低浓度α生育酚对神经元细胞膜的保护作用.doc

1 低浓度α拟生育酚对神经元细胞膜的保护作用作者:梁伟伦黄慧玲武俏丽王辰张文治苏心只达石【摘要】目的: 探讨低浓度α拟生育酚对神经元细胞膜的保护作用. 方法: 培养 SD 胎鼠皮层神经元细胞作为实验对象. 将神经元细胞进行分组:正常对照组、氧自由基损伤组和不同浓度α拟生育酚处理组(10 , 20, 40和 80 mg/L). 用 Fenton 反应对神经元细胞膜造成损伤. 在损伤后 1及2h分别对各组神经元进行 PI 染色, 利用激光共聚焦显微镜观察神经元细胞膜的损伤情况,并用 TBA 法检测神经元细胞外液中丙二醛(MDA) 生成量. 结果: 80 mg/L 浓度α拟生育酚可减少氧自由基对神经元细胞膜的损伤, 且可减少 MDA 生成量. 结论: 80 mg/L 浓度α拟生育酚可以有效对抗氧自由基对神经元细胞膜的损伤. 【关键词】α拟生育酚神经元细胞膜低浓度 0 引言 2 氧自由基是引起颅脑损伤等多种中枢神经疾病继发损伤的重要因素. 而维生素 E E 共包括 8 种分子,其中α拟生育酚为公认抗氧自由基最有效的[ 1]. 在近年的研究中,已证实α拟生育酚可阻止氧自由基对细胞膜中多不饱和脂肪酸及膜蛋白的攻击,防止细胞膜功能的丧失[2]. 然而国内外学者对应用多大浓度的α拟生育酚才可有效保护细胞膜有很大分歧. 本实验我们利用 Fenton 反应形成氧自由基对胚胎大鼠皮层神经元的损伤,观察低浓度α拟生育酚对神经元细胞膜的保护作用. 1 材料和方法 材料α拟生育酚、碘化吡啶( PI )染料( Sigma 公司, 美国); g/L 胰蛋白酶、 mol/L EDTA 、各种细胞培养液( GibcoBRL 公司,美国); MDA 检测盒,购于南京建成生物公司; 300 mL/L 双氧水, 硫酸亚铁, 维生素 C 和无水乙醇, 14d的 SD 大鼠 2 只,购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心. TE200 拟E 型激光共聚焦显微镜观察( NIKON 公司, 日本); TG 拟 150 型二氧化碳培养箱(Jouan 公司, 法国); CR 拟 22G 型离心机( 日立公司, 日本); UV240 型紫外分光光度计(岛津公司,日本) . 3 方法 α拟生育酚水溶液配制取α拟生育酚 10 mg 溶于 1mL 无水乙醇中,将无水乙醇缓慢滴入 49 mL 30℃去离子水中, 制成 200 mg/L α拟生育酚水溶液母液备用. 碘化吡啶染料配制: 将碘化吡啶粉末以去离子水溶解为终浓度为 1 mg/L 工作液. 大鼠皮层神经元分离及培养将实验大鼠断颈处死, 取胚胎脑皮层组织, 剪碎,用 g/L 胰蛋白酶和 mmol/L EDTA , 令其分散成单细胞悬液,过 200 目不锈钢网,于 37℃, 50 mL/L CO2 培养箱中进行培养. 隔日换液. 培养到第 4日, 细胞悬液于离心机中以 1000 r/min 速度离心 10 min , 去沉淀细胞, 加入神经元培养液, 接种于涂有鼠尾胶原的 25 cm × 25 cm 细胞培养瓶中, 使干细胞转化为神经元, 隔天换药一次, 第6 日使用. 实验分组将所有神经元培养瓶进行分组,共分为:正常对照组; 氧自由基损伤组; 不同浓度α拟生育酚处理组( 10, 20, 40和 80 mg/L 亚组,与神经元作用 1h 后备用) . 4 利用 Fenton 反应造成神经元氧自由基损伤按照 Yamazaki 等[ 3 ]方法,在培养皿中加入硫酸亚铁、维生素 C和 300 mL/L 双氧水,使溶液中硫酸亚铁终浓度为 mmol/L, 维生素 C 终浓度为 mmol/L , 双氧水终浓度为 mmol/L ,制作氧自由基损伤模型. 染色按照袁兰等[ 4 ]方法,将 PI 粉末以去离子水溶解为终浓度 1 mg/L 工作液. 将氧自由基损伤组及α拟生育酚处理组及正常组培养瓶中加入试剂后,立即开始计时,并取反应开始后 1和2h 培养瓶中的神经元进行 PI 染色,将PI 工作液 100 μL 均匀滴在神经元细胞上,置于暗室中染色 15 min ,用 pH PBS 液冲洗 3遍. . 6 激光共聚焦显微镜观察细胞形态激光共聚焦显微镜荧光激发波长为 567 nm ,发射光波长大于 590 nm ,伪彩色采用红色,在保证信噪比的情况下尽量增大检测的 pinhole 和 PMT. 选定 5 个图像清晰的视野,在 200 倍镜下观察. 细胞红染者为细胞膜损伤细胞, 未染色者为正常细胞[4]. 每个视野随机计数 100 个神经元, 记录其