低表达Cbfa1基因的人牙周膜细胞模型的建立及鉴定.doc

1 低表达 Cbfa 1 基因的人牙周膜细胞模型的建立及鉴定【摘要】目的:构建针对核心结合因子 a1( Cbfa1 )的 mU6 小干扰 RNA 载体,并将其转染到人牙周膜细胞 hPDLCs ,观察其干扰效果,以期建立稳定的低表达 Cbfa 1 基因的 hPDLCs 模型. 方法:设计针对 Cbfa1 基因编码区的寡核苷酸链, 体外退火后克隆入经双酶切线性化的小干扰载体 mU6 中, 对重组质粒进行酶切分析和 DNA 序列测定. 以脂质体法将 mU 6 空载体和重组质粒分别导人 hPDLC s 细胞系. 用含 G418 的培养液筛选,挑取阳性克隆后用 RT 拟 PC R 技术检测各 hPDLCs 克隆内 Cbfa1 mRNA 水平的表达情况. 结果: 经酶切鉴定及 DNA 测序, 重组质粒 Cbfa1 拟 siRNA 中插入的目的基因片段与预计片段完全一致. G41 8 筛选转染细胞 4wk 后获得稳定转染 mU6 空载体的细胞克隆株 hPDLCs 拟 mU 6 和稳定转染重组质粒的细胞克隆株 hPDLCs 拟 siRNA. 经 RT 拟 PCR 鉴定, Cbfa1 在 hPDLCs 拟 siRNA 细胞中的表达比对照细胞明显降低. 结论:成功构建了针对 Cbfa1 的小干扰 RNA 载体,成功建立了稳定的低表达 Cbfa1 的 hPDLC s 模型,为进一步研究 Cbfa1 的功能奠定了实验基础. 2 【关键词】 Cbfa1 基因 0 引言核心结合因子 a1( core binding factor a1, Cbfa1 ) 是一种成骨分化特异性转录因子,参与了成骨细胞的发生与分化, 对维持骨的生长发育起着关键作用[ 1-4 ]. 研究[ 5-7 ] 发现, Cbfa1 在牙齿发育过程中呈保守表达, 可能是牙齿发育和矿化的重要转录调控因子, 在牙齿发育过程中发挥重要作用. 我们以人牙周膜细胞( hPDLCs ) 为对象, 建立了低表达 Cbfa 1 的细胞模型, 为进一步研究 Cbfa1 的功能奠定了实验基础. 1 材料和方法 材料 hPDLCs 引自美国典型培养物保存中心() ; mU6 载体为美国 Michigan 大学医学院 Tumer 教授赠送; T4 DNA 连接酶、各种限制性内切酶( TaKaRa 公司); 脂质体转染试剂 Lipofectamine2000 (美国 Invitrogen 公司); RPMI 1640 , G418 ( Gibco 公司); RNA 抽提试剂盒(上海华舜公司) . siRNA 载体的构建根据 GenBank Cbfa1 基因 3 的已知序列设计其 siRNA 的序列:上游引物: 5′拟 gcttttt 拟3′, 下游引物: 5′拟 ctagaaaaagcggagtagttctcgtcattgtatgacga 拟 g 拟3′. 上述序列用 BLAST 软件进行同源分析证实为 Cbfa1 高度保守后,由 Sangon 公司合成. 退火后酶切 mU6 质粒,行 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳,回收线性化载体,将退火产物和回收产物定量后于 16℃连接 16h, 将连接产物转化大肠杆菌 DH5 α感受态细菌. 37℃培养 12~ 18 h. 挑选单克隆扩增后进行酶切鉴定和 DNA 测序. 1.