1 体外 siRNA 抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因的表达作者:杨明峰,刘安定,郑专,陈建军,董学君【摘要】目的: 筛选能高效抑制乳腺癌细胞株 MCF 拟7 和 MDA 拟 MB 拟 453 端粒逆转录酶( hTERT ) 基因表达的 RN A 干扰靶点,为乳腺癌的基因治疗提供依据. 方法: 构建针对 hTERT 基因的三种 siRNA(siRNA 拟 hTERT1, siRNA 拟 hTERT2 和 siRNA 拟 hTERT3) ,分别转导入乳腺癌细胞株 MCF 拟7和 MDA 拟 MB 拟 453 ,同时以无同源性的 siRNA 拟 hTERT4 作阴性对照,含 GFP 基因的载体作阳性对照. 应用实时聚合酶链反应( real 拟 time PCR )和 Western Blot 技术检测 siRNA 处理前后 hTERT 基因表达变化; MTT 法检测细胞生长率; 流式细胞术分析基因沉默对细胞凋亡的影响. 结果: 与阴性对照组相比, siRNA 拟 hTERT1 , siRNA 拟 hTERT2 和 siRNA 拟 hTERT3 三个实验组 siRNA 转染细胞后, hTERT 的 mRNA 表达量下调至 21%~40% ,蛋白表达下降至 50% ,而三个实验组间差异无统计学意义( ). 转染 48h后, MCF 拟7 细胞抑制率分别为(57 ± )% ,( 61± )%,( 65± ) 2 %; MDA 拟 MB 拟 453 细胞抑制率分别为( 45± )%,( 45± ) %,( 50± ) %. 流式细胞仪检测结果显示,细胞凋亡率有所增加, MCF 拟7 细胞为( ± )% , ( ± )% , ( ± )% ; MDA 拟 MB 拟 453 细胞为( ± )% , ( ± )%,( ± ) %. 结论: 经 siRNA 拟 hTERT1 , siRNA 拟 hTERT2 , siRNA 拟 hTERT3 处理均可明显抑制 MCF 拟7和 MDA 拟 MB 拟 453 乳腺癌细胞的增殖及 hTERT 基因的表达,能够明显促进细胞的凋亡. 【关键词】乳腺肿瘤;端粒酶逆转录酶; RNA 干扰 0 引言端粒逆转录酶( human telomerase reverse transcriptase , hTERT )是端粒酶组成的亚单位,与肿瘤的发生、发展密切相关[ 1-2 ]. 新近的研究[ 3-4 ]表明,应用小片段干扰 RNA ( siRNA ) 沉默或下调 hTERT 表达, 可降低端粒酶的活性, 缩短端粒, 从而使肿瘤细胞的生长受到抑制[ 5-6 ].不同 siRNA 转染效率的不同以及靶向 hTERT 的不同, siRN A 对端粒酶活性抑制的程度也有所不同[7]. 本研究拟通过设计多对靶向 hTERT 基因的 siRNA ,转导入不同的乳腺癌细胞株,筛选出具有特异性下调 hTERT 基因表达的 siRNA , 3 材料和方法 材料乳腺癌 MCF 拟7和 MDA 拟 MB 拟 453 细胞株( 上海细胞生物研究所); M2000 转染试剂,总 RN A 提取试剂 Trizol , real 拟 time PCR 试剂盒( 大连 TakaRa 公司); 兔抗 hTER T 多克隆抗体, 辣根酶标记羊抗兔 IgG (美国 Sigm a 公司); CO2 孵育箱( HEPA CLASS 100, 德国 Thermo 公司); 实时荧光定量(real 拟 time) PCR 仪( Light Cycle ,美国 Roch e 公司); 流式细胞仪( EPICS XL , 美国 Coulter Beckma 公司); 蛋白电泳和电转仪( VE 拟 186 , 中国上海天能科技有限公司) . 方法 设计根据 hTERT 基因的 DNA 序列( GenBank accession )设计出互补的 3 对( siRNA 拟 hTERT1 , siRNA 拟 hTERT2 和 siRNA 拟 hTERT3 ) siRNA 序列[8], siRNA 拟 hTERT4 为无同源性的阴性对照序列. siRN A 片段由广州锐博生物科技有限公司合成,其序列为: siRNA 拟 hTERT1 正义链: 5′拟 dTdT 4 拟3′, 反义链: 5′拟 GGGAGG 拟3′; siRNA 拟 hTERT2 正 义链: 5′拟 GAGCGUCUCAdTdT 拟3′,
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