体外内层血视网膜屏障模型中Müller胶质细胞对紧密连接的影响.doc

1 体外内层血视网膜屏障模型中 Mü ller 胶质细胞对紧密连接的影响【摘要】建立体外内层血视网膜屏障( iBRB )模型并研究视网膜 Mü ller 胶质细胞( RMGC ) 对紧密连接( TJ)的影响。方法: 采用免疫磁珠方法原代纯化和培养大鼠视网膜微血管内皮细胞( RMEC ) ,采用改良酶消化方法培养 RMGC , RMEC 和 RMGC 在微孔膜的两侧共培养建立 iBR B 模型, 通过相差显微镜和透射电子显微镜( TEM ) 观察两种细胞的生长和 TJ 的形态。采用跨内皮细胞电阻( TER )测量和 TJ 相关蛋白 ZO-1 荧光染色和蛋白电泳来评价 TJ 的变化情况。结果: RME C和 RMG C 均可在膜上正常生长, RMG C 间紧密连接。 TEM 观察高 TER 值样品中相邻 RMEC 形成典型的 TJ 结构。 RMEC 层 TER 在 8d 时达到最高,为( ± ) Ω· cm2 , 此后保持相对稳定。在 RMGC 存在的共培养组 TER 7d 时为( ± ) Ω· cm2 , 约为 7d时 RMEC 组的 2倍,8d 达到峰值( ± ) Ω· cm2 。在 iBRB 模型发展过程中, ZO-1 的表达强度随时间延长而增加。结论: 通过 RMEC 和 RMGC 的共培养可以建立体外 iBRB 模型, RMGC 加快 RMEC 间的 TJ 成熟。 2 【关键词】视网膜 0 引言视网膜为了有效地发挥其功能,需要一个稳定的内环境, 这一内环境稳定性的维持依赖于内层血视网膜屏障。内层血视网膜屏障是由视网膜微血管内皮细胞( RMEC )、 RME C 间紧密连接( TJ) 、基底膜、周细胞、胶质细胞足突和极狭小的细胞外间隙共同组成的一个复合体, 是存在于视网膜神经层的血管与神经组织之间的一个动态的调节界面[1-3] 。在动物体内许多实验已经得出血视网膜内屏障中,视网膜 Mü ller 胶质细胞( RMGC )与 RMEC 之间存在多种形态和功能学上的联系, 但这些因素受到动物个体差异、种群差异及其它神经组织的影响, 于是就需要建立一种简化的内层血视网膜屏障( iBRB ) 的体外模型。我们采用原代培养的 RMG C 与 RMEC 建立体外 iBRB 模型,并研究 RMGC 对于屏障 TJ 的作用。 1 材料和方法 3 材料① RMEC 培养及鉴定:选择 Wistar 大鼠 15 只, ***麻醉处死,取出眼球,置于含有青霉素/ 链霉素的 PB S 中浸泡 5min 取出,无菌操作取出视网膜,用 PBS 冲洗,剪碎, 1g/L Ⅰ型胶原酶( Sigma )消化 30min ,过双层的 53μm 尼龙筛网(上海德华金属网带有限公司) ,收集滤液离心, 洗涤细胞,加入 PECAM 抗体包被的免疫磁珠, 4℃孵育 30min , 置于磁珠分离装置( MCP-1, Dynal )上用 100mL/L FB S 洗涤结合磁珠的细胞,将细胞接种于明胶包被的培养板中, 加入含 75g/L 内皮生长添加剂( Sigma )的 100mL/L 胎牛血清( FBS ,杭州四季青)的培养液。细胞培养箱( Heraeus ) 环境为 37℃, 50mL/L CO2 , 950mL/L 空气,细胞扩增传代采用 胰酶( Gibco )和 EDTA (1∶1) 混合消化液( TE )。 RMEC 鉴定采用兔抗大鼠Ⅷ因子抗体( Zymed ) 免疫组化染色。② RMGC 的培养及鉴定:出生 2d的 Wista r 新生鼠麻醉处死,取出眼球,剥离视网膜,用 PBS 冲洗,剪碎,用 胰酶消化 20min , 加入 100mL/L FBS 终止消化, 经 53μm 尼龙筛网,细胞悬液离心洗涤后接种于培养板中, 加入 100mL /L FBS 培养液。培养环境及传代方法同 RMEC 。 RMGC 鉴定采用兔抗大鼠 GFAP ( Dako )和小鼠抗大鼠 vimentin ( Dako )免疫组化染色。③体内 iBRB 模型建立方法采用改良 Tretiach 等[4] 和 Nakashima 等[5] 方法, 预先使用 10g/L 明胶包被的聚酯材料、微孔孔径 μm 、微孔膜面 4 积 的 Transwell ( No. 3450 , Corning ) 小室。第5~ 6代 REMC 生长接近 70% 时, 弃去血清培养液, 加入无血清培养液, 继续培养 24h 。取第 3~4 代生长状态良好的 Mü ller 细胞,换液加入 RMEC 培养基,继续培养 24h 以上。 TE 消化两种细胞制成单细胞悬液,共培养组先将 Transwell 小