关节软骨撞击伤后软骨细胞凋亡的实验研究.doc

1 关节软骨撞击伤后软骨细胞凋亡的实验研究作者:邵世坤,裴福兴,狄东华,赵建忠【摘要】目的]用 TUNEL 标记法和透射电镜来观察软骨撞击伤后软骨细胞凋亡的演变情况。[ 方法] 56 只健康成年新西兰大白兔,随机分高、低能量两组,每组 28 只,随机选取一侧后肢为实验组, 另一侧为对照组; 不同重量的击锤撞击股骨内侧髁软骨面致不同的损伤。术后 4d,1、2、4、 8、 16、 32 周收集标本, 每个时间组 4 只兔子, 进行 TUNE L 标记法和透射电镜来观察软骨细胞的凋亡。[结果]对照组标本中在软骨的中间层和钙化层, 出现凋亡细胞。低能量组中,伤后 4d,1、2 周的标本中,软骨的移形层和过渡层出现凋亡细胞,细胞凋亡率与对照组之间无统计学意义; 4周后的标本中凋亡细胞明显减少, 细胞凋亡率与对照组之间无统计学意义。高能量组中,伤后 4d 软骨浅表层和移形层中出现凋亡细胞,而且伤后时间越长凋亡细胞所占比率越大, 细胞凋亡率与对照组之间有统计学意义。[结论]软骨高、低能量撞击伤后早期软骨细胞均出现凋亡, 凋亡率高于对照 2 组;但低能量伤后 4 周软骨细胞凋亡率恢复到对照组水平; 高能量伤后软骨细胞凋亡率随时间逐渐增高。【关键词】软骨损伤; 软骨细胞; 凋亡; 创伤性骨关节炎近来的研究表明, 骨关节炎和体外软骨损伤模型中, 可观察到软骨细胞的凋亡。随着骨关节炎严重程度加重,软骨细胞的凋亡率也随之增加, 机械损伤也能诱导软骨细胞的凋亡,后者可能是软骨细胞对机械损伤的最早反应之一[ 1,2 ] 。体内关节软骨受到撞击伤后,软骨细胞的凋亡率如何演变人们还缺乏足够的认识。本实验在 Newberry 、 Vraha s 模型的基础上,建立兔股骨内侧髁软骨损伤不同的模型,用 TUNEL 标记法和透射电镜观察软骨损伤后软骨细胞凋亡的演变情况。 1 材料与方法 动物及分组 56 只健康成年新西兰大白兔, 雌雄不限, 体重 ~ 3 kg ,随机分为轻、重 2 组,每组 28 只,随机选取一侧后肢为实验组, 另一侧为对照组。再随机分为术后 4d,1、2、4、 8、 16、 32周7 个时间组,每组 4 只动物。 关节软骨损伤模型的建立 5 %水合***醛 ml/ kg 腹腔注射麻醉,取仰卧位,脱毛,常规消毒铺巾。 膝关节内侧纵形切口,长 3 cm ,依次切开皮肤、皮下组织、深筋膜、关节囊, 将髌骨外翻, 膝关节屈曲 120 °, 使股骨干与水平面垂直, 骨盆固定带固定骨盆, 用大腿固定带固定大腿防止撞击时不稳定。 用 、 kg 的击锤分别于 46、 20 cm 高处通过导杆自由坠落,产生的能量为 J( 能造成胶原网架断裂) 和 J( 不能造成胶原网架断裂)[2、3], 再通过撞击体致股骨内侧髁软骨面的损伤。对照侧不行撞击, 余步骤同试验组。术毕庆大霉素生理盐水冲洗关节腔, 逐层缝合伤口。麻醉清醒后笼内自由活动。术后肌注青霉素 20 万单位, 每日 2次, 连用 3d。 4 (4) 于术后 4d,1、2、4、8、 16、 32 周收集标本,进行 TUNEL 标记法和透射电镜来观察软骨细胞的凋亡。 形态学观察 取材、固定各组于观察期满后,在相同位置用锋利双面刀片软骨下骨处切取 cm × cm × cm 的软骨,不取软骨下骨, 避免了因标本脱钙过程中破坏细胞造成假阳性。标本切成 2 等份,1 份立即置于 10 %中***尔马林溶液中在室温下固定 24h 后,石蜡包埋组织块,作连续切片,片厚为 51μm ,制成病理切片备用。另 1 份备做透射电镜之用。 TUNEL 末端标记病理切片常规脱蜡,梯度酒精补水后,切片滴加蛋白酶K 修复抗原。滴加 20 %小牛血清和 3 %小牛血清白蛋白封闭非特异性反应。在 DNA 片段标记后,用 %H2O2 阻断内源性过氧化物酶,室温, 15 min 。切片滴加 20 %羊血清、 3 %小牛血清白蛋白及 1 %封阻剂, 37℃, 15 min , 再次封闭非特异性反应。切片滴加 1∶2 稀释的 POD 20μl, 置湿盒内, 5 37℃, 30 min 进行免疫反应, 扩大信号。镜控下, DAB 拟 H2O 2 显色。胞核呈深棕色即用自来水流水冲洗终断反应。苏木精复染。梯度酒精脱水,二甲苯透明,树胶封片。 透射电镜将标本放入 5 %戊二醛保存液中浸润保护, 用锋利的双面刀片冠状面将软骨切成 1 mm3 小块, 立即投入 4℃5 %戊二醛溶液中固定 24h 后, mol /L 二甲***酸钠缓冲液() 漂洗 24h。1 %锇酸后固定