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SDS- SDS- 聚丙烯酰***凝胶电泳聚丙烯酰***凝胶电泳( ( PAGE PAGE ) )测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量授课教师:周杰授课教师:周杰一一. . 实验目的实验目的??学****学****SDS-PAGE SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原测定蛋白质分子量的原理。理。??掌握垂直板电泳的操作方法。掌握垂直板电泳的操作方法。??运用运用 SDS-PAGE SDS-PAGE 测定蛋白质分子量及染测定蛋白质分子量及染色鉴定。色鉴定。二二. .实验原理实验原理??带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动,这带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动,这种现象称为电泳种现象称为电泳。。??电泳分类:移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。电泳分类:移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。??区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液,然后加电场,分子在支持介质上或支层样品溶液,然后加电场,分子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。产生的对流。??区带电泳使用不同的支持介质,早期有滤纸、玻璃区带电泳使用不同的支持介质,早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚***乙烯树珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚***乙烯树脂;以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜, 脂;以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜, 现在则多用聚丙烯酰***( 现在则多用聚丙烯酰***( PAGE PAGE ) )和琼脂糖凝胶。和琼脂糖凝胶。二二. . 实验原理实验原理?? PAGE PAGE 根据其有无浓缩效应,分为连续系统根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液中缓冲液 pH pH 值及凝胶浓度相同,带电颗粒值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分, 不连续系统中由于缓冲液离子成分, pH pH , , 凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。清晰度及分辨率均较前者佳。二二. . 实验原理实验原理?? SDS- SDS- 聚丙烯酰***凝胶电泳,是在聚丙烯酰***凝胶系统中聚丙烯酰***凝胶电泳,是在聚丙烯酰***凝胶系统中引进引进 SDS SDS ( ( 十二烷基磺酸钠), 十二烷基磺酸钠), SDS SDS 能断裂分子内和分能断裂分子内和分子间氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,强还原剂能使子间氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂,蛋白质在一定浓度的含有强半胱氨酸之间的二硫键断裂,蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的还原剂的 SDS SDS 溶液中,与溶液中,与 SDS SDS 分子按比例结合,形成带负分子按比例结合,形成带负电荷的电荷的 SDS- SDS- 蛋白质复合物,这种复合物由于结合大量的蛋白质复合物,这种复合物由于结合大量的 SDS SDS , , 使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白子大小为特征的负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异,由于质分子之间天然的电荷差异,由于 SDS SDS 与蛋白质的结合是与蛋白质的结合是按重量成比例的,因此在进行电泳时,蛋白质分子的迁移按重量成比例的,因此在进行电泳时,蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在速度取决于分子大小。当分子量在 15 15 KD KD 到到 200 200 KD KD 之间时, 之间时, 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式: 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式: logMW logMW =K- =K- bX bX ,式,式中: 中: MW MW 为分子量, 为分子量, X X 为迁移率, 为迁移率, k k、、b b 均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。得分子量。二