分子生物学实验操作方法与技巧(3).ppt

分子生物学与生物化学实验操作、设计与技能
DNA和RNA提取方法;酶切与连接。
李刚副教授
二、DNA和RNA提取方法
细菌DNA的常规制备方法;
细菌DNA PCR模板的快速制备方法;
细菌基因组DNA提取试剂盒的选择;
酵母DNA的常规制备方法;
酵母DNA PCR模板的快速制备方法;
细菌基因组DNA提取试剂盒的选择;
二、DNA和RNA提取方法
植物、真菌DNA的小量制备方法;
植物(真菌)DNA extract Kit的选择;
动物组织或细胞中RNA的制备;
真菌(植物)RNA的制备;
植物和真菌RNA提取试剂盒的选择。
RNA提取过程中的注意事项;
鉴定所提RNA质量的方法和技巧。
细菌DNA的常规制备方法
将培养后离心得到的菌体经过生理盐水洗涤2遍后,取TENS提取液(, , 20mM Na2EDTA,100mM NaCl, 1% SDS)3mL ºC水浴保温2分钟后取出,待其自然冷却后,离心15分钟(8000g, 4 ºC), 收集其上清液。:***仿:异戊醇(25:24:1),离心15分钟(12000g, 常温),***仿:异戊醇(24:1),再次离心15分钟(12000g,常温), NaAC(),混匀,置于-20ºC 30分钟,离心15分钟(12000g, 4ºC),弃上清保留沉淀。并用75%的乙醇洗涤沉淀,离心,控干后溶于100微升TE或无菌水中,加RNase至终浓度为20 µg/mL, 37 ºC处理30分钟, 取少量电泳,其余放-20ºC保存备用。
该方法所提细菌DNA适于作为PCR反应的模板,如果该方法所提细菌DNA将用于建立基因组文库,则最好先将这些DNA用相应的细菌DNA提取试剂盒或DNA纯化试剂盒进行纯化后再用于建库。
细菌DNA PCR模板的快速制备方法(1)
微波炉法:
用接种环刮取大肠杆菌菌落, eppendorf离心管里,加上20 µL TE(),振荡,盖上盖子。如果是菌液,,彻底倒尽上清液。用无菌双蒸水或TE洗涤一次, 13000r/min离心15秒,去上清,悬浮在残存液体里,盖上盖子。在750W家用微波炉高热处理30S,内置一盛水的烧杯,以免损坏微波炉。振荡1分钟,13000r/分离心2min。将上清储存在-20 ºC。取1-2 µL做为PCR反应的模板。
细菌DNA PCR模板的快速制备方法(2)
煮沸法:
用接种环刮取大肠杆菌菌落, eppendorf离心管里,加上20 µL TE(),振荡,盖上盖子。如果是菌液,,彻底倒尽上清液。用无菌双蒸水或TE洗涤一次, 13000r/min离心15秒,去上清,悬浮在残存液体里,盖上盖子。在沸水上煮2min。13000r/min离心2分钟。将上清储存在-20ºC。取1-2 µL做为PCR反应的模板。
通过多次实验的比较,个人认为煮沸法制备的细菌DNA PCR模板的质量和方法的重复性,要优于微波炉法。
细菌基因组DNA提取试剂盒的选择
首选QIAGEN公司的,因为其核酸提取试剂全球领先,因而其种类最全。当然价格也比较昂贵。另外,有非常多的国内公司都生产细菌基因组DNA提取试剂盒,如:北京天根生化科技有限公司、广州东盛生物科技有限公司、杭州博日科技有限公司,北京百泰克生物技术公司,广州誉维生物科技有限公司等。这些试剂盒的质量应该都可以满足要求。
这里推荐四款我用过的、效果不错的试剂盒供大家参考:
DW09-1:细菌基因组DNA快速提取试剂盒(广州东盛生物科技有限公司);
DNA Kit(Omega公司,广州飞扬生物工程有限公司生产);
细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)
快速DNA提取扩增套装(北京天根生化科技有限公司)。
上述四款产品,前三款产品提取的DNA既可用于PCR,也可用于建库,而第四款产品提取的DNA只能用于PCR。
酵母DNA的小量制备方法(1)
实验原理:
首先酶解消化酵母细胞壁,制备原生质体。然后用SDS裂解产生的原生质体,释放出基因组DNA,从而可以制备其总DNA。
程序:
1、用10mLYPD培养基培养酵母。将酵母培养物在30°C、中度振荡条件下培养过夜,至OD600=-(约为3107个细胞/mL)。
2、取5mL (4100r/Min,Sorvall