野生型PTEN基因对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖、凋亡和侵袭活性的影响.doc

野生型PTEN基因对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖、凋亡和侵袭活性的影响.doc野生型PTEN基因对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖、凋亡和侵袭活性的影响
作者:王素云成志勇邓凯陈浩姚丽杨静慈尚银涛潘崚
【摘要】目的探讨外源性野生型PTEN基因对人多发性骨髓瘤(MM)细胞株RPMI8226增殖、凋亡、侵袭活性的影响以及PTEN/FAK信号传导通路在细胞侵袭活性中的作用。方法将携带人野生型PTEN及绿色荧光蛋白的腺病毒(AdPTENGFP)及空载体腺病毒(AdGFP)体外转染至RPMI8226细胞。通过MTT法检测细胞生长曲线,Hoechst33342染色检测细胞凋亡,荧光定量PCR(FQPCR)检测PTEN及FAK mRNA水平变化,ML)病人常见PTEN缺失〔4〕,强力提示PTEN在调节造血细胞增殖、凋亡、恶性转化中的作用。PTEN通过负调控多种信号传导途径,来调节细胞周期进展、细胞凋亡和肿瘤细胞迁移和侵袭。其中PTEN/FAK信号传导通路在影响细胞的增殖、凋亡、侵袭等生物学行为方面起着重要作用。既往尚无资料显示PTEN是否能够影响MM细胞的增殖和侵袭。因此,我们将重组腺病毒介导的野生型PTEN基因导入人MM细胞株RPMI8226,使PTEN基因在RPMI8226细胞中高表达,观察其对RPMI8226细胞增殖、凋亡和侵袭活性的影响,研究PTEN/FAK的表达水平,以进一步了解MM发生发展中可能存在的分子机制,为探索MM基因治疗提供新思路。
1 材料与方法
材料重组腺病毒AdPTENGFP和AdGFP由上海吉凯生物公司合成并鉴定,在293A细胞中进行扩增及滴度测定。人MM细胞株RPMI8226细胞和人胚肾细胞系293A细胞均为本实验室长期保存细胞系。RPMI8226细胞用含15%胎牛血清(杭州四季青)RPMI 1640培养基培养,293A细胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培养基培养,均在37℃、5%CO2,饱和湿度环境孵育。
病毒转染及效率的测定将100 μl含病毒液的无血清培养液加入RPMI8226细胞中,感染复数(Multiplicity of infection,MOI)为100,在37℃,5% CO2条件下培养2 h,置于含15%胎牛血清RPMI 1640培养液继续培养。流式细胞仪计算转染效率。
MTT法测定细胞抑制率取对数生长期RPMI8226细胞,分为对照组、转染AdGFP组、转染AdPTENGFP组,以1×104个/孔接种于96孔板培养,每组3个复孔,实验重复三次,每孔200 μl。按MOI=100转染细胞,于不同时间点每孔加入MTT溶液,孵育4 h后离心弃上清,另加入二***亚砜(DMSO)振荡数分钟,选择OD490 nm波长,在酶标仪上测定各孔的吸光度A值。抑制率=(对照组A-试验组A)/对照组A
×100%。
细胞凋亡率检测 Hoechst33342染色检测细胞凋亡:分别收集转染后不同时间不同组的RPMI8226细胞,取100 μl细胞悬液,加入荧光染料Hoechst33342至终浓度为10 μg/mL。常温避光染色15 min,取40 μl细胞悬液,在激发波长为350 nm荧光显微镜下观察结果并计数10个视野(200个细胞/视野),计算凋亡细胞所占比例。
实时荧光定量PCR检测PTEN、FAK基因表达分