针对caspase3基因的RNA抑制对帕金森病细胞的抗凋亡作用.doc

针对caspase3基因的RNA抑制对帕金森病细胞的抗凋亡作用.doc针对caspase3基因的RNA抑制对帕金森病细胞的抗凋亡作用
作者:焦成国陈加俊宋冬晶刘斌黄燕苹
【摘要】目的探讨针对caspase3基因的 RNA抑制对帕金森病细胞的抗凋亡作用。方法 NGF诱导PC12细胞为类神经细胞。细胞随机分为对照组、模型组、GFP siRNA组、caspase3 siRNA组。对照组用完全培养液培养,其他3组细胞用6羟基多巴***制作帕金森病细胞模型。于制作模型前24 h进行转染。造模后对caspase3及细胞凋亡率等指标进行检测。结果(1)凋亡率:模型组细胞凋亡率〔(±)%〕明显高于对照组〔(±)%〕,有显著性差异(P<);caspase3 siRNA组〔(±)%〕明显低于模型组(P<)。(2)caspase3阳性率:模型组的caspase3阳性率〔(±)%〕明显高于对照组〔(±)%〕,差异有统计学意义(P<);caspase3 siRNA 组caspase3阳性率〔(±)%〕明显低于模型组,差异有统计学意义(P<)。结论针对caspase3的 siRNA能有效地抑制帕金森病细胞凋亡,对6羟基多巴***毒性作用下的神经细胞损伤有一定的保护作用。
【关键词】帕金森病;RNA干扰;细胞凋亡
近年来研究表明,细胞凋亡在帕金森病的病理机制中起重要作用。细胞凋亡涉及多种基因的复杂变化,其中凋亡促进基因caspase3与之关系密切〔1,2〕。基因干预可通过降低凋亡基因的表达而对细胞凋亡起到干预作用。本实验用6羟基多巴***作用于NGF诱导后的PC12细胞,建立帕金森病细胞模型,用RNA干扰(RNAi)方法对Fas基因表达进行抑制,从而观察该方法对帕金森病细胞凋亡的影响。
1 材料与方法
细胞培养和诱导
PC12细胞于完全培养液(RPMI1640+15%新生牛血清+青霉素)中培养,每3 d换液1次,5~6 d传代1次。取对数生长期PC12细胞,消化、离心后用完全培养基重悬,密度为105/ml,待80%汇合时吸去旧的培养液,加入新培养液备用。成熟的PC12细胞接种于含有50 ng/ml(约2 nmol/L)NGF的完全DMEM培养液中,×104~10×104/cm3,每2~3 d换液1次。约1 l,待80%汇合时吸去旧的培养液,加入新培养液备用。将模型组、GFP siRNA组、caspase
3 siRNA组细胞接种于162 cm2组织培养板中,待细胞贴壁成单层后,去上清,加入6羟基多巴***培养24 h后进行caspase3表达及细胞凋亡相关检测。
caspase3 siRNA序列
caspase3正义链:5′ GGAACGATAATGTC
AAA3′,反义链:5′AGCTTTTGGAAAAA
ACTTGACATTATCGTTCTCTCTTGAAGAACGATAATGTC
AAGTGGTACGG3′(试剂购自大连宝生物公司)。
TUNEL法检测细胞凋亡
脱氧核苷酸末端转移酶介导缺口末端标记法(TUNEL) 用细胞凋亡试剂盒(罗氏公司) 。细胞用40 g