针对HBVx基因的siRNA重组腺病毒的制备及其对HBVx基因表达的抑制作用.doc针对HBVx基因的siRNA重组腺病毒的制备及其对HBVx基因表达的抑制作用
作者:秦炜炜,刘家云,张瑞,王涛,王凯,孟艳玲,杨安钢
【关键词】乙型肝炎病毒;,RNA干扰;,腺病毒;,基因治疗
Preparation of rebinant adenovirus mediated siRNA targeting HBVx gene and its suppressive effect on HBVx gene expression
【Abstract】 AIM: To construct the rebinant adenovirus vectors for siRNA targeting HBVx gene (HBx) and to evaluate the inhibitive effect on the expression of HBx gene in human hepatoma HepG2 cell line. METHODS: The shuttle vector pShuttleHBx id. The homologous rebinants plified, folloined by RTPCR and 2000,RTPCR试剂盒和TRIZOLTM试剂(Invitrogen公司); myc标签, EGFP多克隆抗体(Santa Cruz公司);兔抗人βactin多克隆抗体和辣根酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(武汉博士德公司);ECL化学发光试剂盒为(Pierce公司). 用于扩增HBx基因的上游引物:5′3′,下游引物:5′TTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTGC3′;用于扩增内参照βactin基因的上游引物: 5′TGCGCAGAAAACAAGATGAGATT3′, 下游引物: 5′TGGGGGACAAAAAGGGGGAAGG3′;用于扩增EGFP基因的上游引物:5′AGCGGGGACAGCAGC3′, 下游引物:5′3′,上述引物由北京三博远志生物技术有限公司合成.
,pShuttleHBx5载体的构建
经Xba I和Hind III双酶切反应,从pSUPERHBx2,pSUPERHBx5质粒获取RNAi表达框片断HBx2和HBx5(大小300 bp左右),将两目的片断回收后亚克隆入同样经Xba I和Hind III双酶切的腺病毒穿梭质粒pShuttle,卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用Xba I和Hind III双酶切,10 mL/L琼脂糖凝胶电泳鉴定. 获得含小干扰RNA (short interfering RNA, siRNA)表达框的腺病毒穿梭质粒pShuttleHBx2和pShuttleHBx5.
,pAdeasyHBx5载体的构建
将pShuttleHBx2,pShuttleHBx5质粒用Pme I酶切线性化,与pAdeasy1按10∶1的比例电转化至BJ5183感受态细菌. 卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆,挑取较小的克隆扩增培养,提取质粒. 用Pme I酶切鉴定质粒,将鉴定正确的重组质粒再次转化DH5α感受态细胞,扩增阳性克隆并大量提取质粒,得到含针对HBx干涉表达框的重组腺病毒质
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