钙拮抗剂对大鼠心肌缺血再灌注早期生长反应基因.doc

钙拮抗剂对大鼠心肌缺血再灌注早期生长反应基因.doc钙拮抗剂对大鼠心肌缺血再灌注早期生长反应基因
作者:李海青,石刚刚,高分飞,贾强用
【摘要】目的: 研究钙拮抗剂(维拉帕米、地尔硫芭卓和硝苯地平)对大鼠心肌缺血再灌注(I/R)芭卓早期生长反应基因-1(Egr-1)表达的影响。方法:大鼠随机分为假手术组、I/R组、二***亚砜组、维拉帕米组、地尔硫芭卓组、硝苯地平组。ethods: Rats ly assigned into Sham、I/R、DMSO、verapamil、diltiazem、nifedipine groups. The expression levels of Egr-1 protEin and mRNA ined by SO,上海凌峰化学试剂有限公司,中国);兔抗大鼠Egr-1多克隆抗体(Santa Crutz公司,美国);HRP标记的山羊抗兔IgG、小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体、HRP标记2抗IgG(博士德公司,中国);***纤维素膜、Trizol试剂、PCR扩增反应试剂盒(Invitrogen公司,美国);Egr-1引物和β-actin引物(上海华美生物工程公司,中国);第一链cDNA合成试剂盒(MBI Fermentas公司,立陶宛);维拉帕米(恒瑞医药股份有限公司,中国);硝苯地平和地尔硫芭卓(Sigma公司,美国)。
心肌I/R模型的建立及分组
大鼠称重,乌拉坦()腹腔麻醉,分离气管后立即行正压人工呼吸(频率60次/min,流量2mL/100g)。从左侧第3、4肋间打开胸腔,暴露心脏,剪破心包膜,用2个小拉钩撑开并向下按压胸廓使心脏暴露于胸腔外,在肺动脉圆锥左缘平左心耳下缘2mm冠状动脉处进针,用5/0丝线穿过心肌层。结扎冠状动脉时连同直径2mm的塑料胶管一起结扎造成心肌缺血60min,然后解除结扎再灌注180min。
大鼠随机分为I/R组(术前5min予NS 1mL/kg,结扎大鼠冠状动脉前降支,60min后松开结扎线,恢复血流,再灌注180min);DMSO组(术前5min改NS为DMSO,手术操作同I/R组);维拉帕米组(,用NS稀释,同样按照1mL/kg给予);地尔硫芭卓组(,用NS稀释成1mL/kg给予);硝苯地平组(,用NS稀释成1mL/kg给予);假手术组(术前5min予NS 1mL/kg,手术时冠状动脉前降支穿线但不结扎,持续观察240min)。
Egr-1蛋白测定
取100mg心肌组织块,用干净的剪刀将组织于冰上快速剪碎,加入预冷的裂解液[20mmol/L Tris·HCl,150mmol/L NaCl,体积分数1%的TritonX-100,1mmol/L乙二***四乙酸;pH ]
μL的Protease inhibitor cocktail Ⅲ,用乳化分散仪将心肌组织于冰上充分匀浆,每一标本匀浆30s冰上静置30s,共匀浆3次,匀浆至无明显组织颗粒为止,冰上静置10min,2655g,离心10min(4℃),弃上清液,加入裂解液200μL,冰上静置裂解2h, 期间不断涡旋使其充分裂解, 然后15294g,离心20min(4℃),吸取部分上清液用考马斯亮蓝法测定蛋