不同年龄大鼠胰腺组织中胰岛素受体与磷脂酰肌醇3激酶表达水平的研究.doc

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伊正辉王林杰常迎彬【摘要】目的:探讨大鼠胰腺组织中胰岛素受体与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的表达随增龄的变化。方法:35只健康SD大鼠按月龄分为五组,分别为1月龄组7只,6月龄组7只,12月龄组7只,18月龄组7只,24月龄组7只。提取胰腺组织蛋白后用Western-Blot方法检测胰岛素受体和PI3K的蛋白水平,应用免疫组化方法检测胰岛素受体的分布。结果:(1)胰腺组织内胰岛素受体集中分布在胰岛细胞表面,腺泡细胞也有表达。(2)1月龄组及18月龄组大鼠胰腺组织中的胰岛素受体蛋白表达量与6月龄组比较差异有统计学意义。1月龄组PI3K蛋白质表达量与6月龄组比较差异有统计学意义。结论:进入老年期,大鼠胰腺组织中胰岛素受体及PI3K的表达升高。
【关键词】胰腺;胰岛素受体;磷脂酰肌醇3激酶
TheExpressionofRatInsulinReceptorandPhosphatidylinositol3-kinaseinPancreasinDifferentAges/YIZheng-hui,WANGLin-jie,CHANGYing-bin//MedicalInnovationofChina,2012,9(14):001-003
【Abstract】Objective:Toevaluatetheexpressionofinsulinreceptorandphosphatidylinositol3-kinase(PI3-kinase):Thirty-fivenormalhealthySprague-Dawleyratsweredividedintoonemonthgroup,sixmonthsgroup,twelvemonthsgroup,eighteenmonthsgroupandtwenty--:Comparedwiththesixmonthsgroup,therewassignificantdifferenceininsulinreceptorandPI3-,:Thereissignificantincreaseininsulinsignaltransductionofpancreasduringaging.
【Keywords】Pancreas;Insulinreceptor;Phosphatidylinositol3-kinase
First-author’saddress:CivilAviationGeneralHospital,BeiJing100123,China
doi:.1674-
衰老是指生物体在生长发育到成熟期后,内环境稳定性逐渐下降,形态结构和生理功能随增龄而发生的退行性变化。这种退行性变化可归因于多种遗传和环境因素。其中葡萄糖/能量代谢进行性衰退是生理功能改变的基本特征之一。胰岛素(insulin,Ins)在葡萄糖和能量代谢中发挥重要作用,并且与细胞生长、增殖及分化密切相关。胰岛素与其受体(insulinreceptor,IR)的有效结合是胰岛素发挥生理效应的关键步骤。与配体结合后的胰岛素受体发生自身磷酸化,而使受体酪氨酸激酶激活,引起信号在细胞内的传导和放大。磷脂酯肌醇3激酶(PI3K)是胰岛素信号转导通路中十分重要的信号蛋白,与胰岛素的代谢效应有关[1]。研究表明,PI3K信号转导途径还参与调节胰岛素的基因转录[2]。在人体各种组织器官中,胰腺组织的胰岛素信号转导通路参与胰腺内、外分泌系统的调节[3],十分具有研究价值。本研究观察年龄增加对胰腺组织内胰岛素受体及其重要的下游信号分子PI3K蛋白表达的影响,探讨胰岛素信号传导分子随年龄的变化。
1材料与方法
。用于Western-Blot测定的胰岛素受体单克隆抗体及PI3K单克隆抗体均购自CELLSIGNALINGTECHNOLOGY公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的Envision放大显色系统工作液、封闭用山羊血清购自丹麦DAKO公司。
,由北京大学医学部实验动物科学部提供,SPF(specificpathogenfree)级,合格证号:SCXK(京2002-0001)。动物按不同发育阶段分为5组:1月龄16只,体质量(±)g;6月龄20只,体质量(±)g;12月龄20只,体质量(686±)g;18月龄19只,体质量(±)g;24月龄13只,体质量(±)g。每组随机抽取7只为实验对象。各试验组大鼠以10%水合***醛(250mg/kg)腹腔内注射麻醉,上腹正中切口进入腹腔,迅速取胰腺组织,均置于冰浴下以PBS液清洗3次,然后分为两部分,一部分液氮冷冻后置于-80℃冻存用于分子生物学检测,另一部分置于中性甲醛液中固定,备行病理学检查。
-Blot检测蛋白质从SDS聚丙烯酰***凝胶转移至***纤维素滤膜。加入胰岛素受体的一抗或PI3K的一抗,封闭过夜,***纤维素膜置于第二抗体中振荡。加入显色缓冲液(NBT/BCIP显色液),室温下摇床上染色。应用激光扫描仪对实验结果图像条带进行扫描,-blotting结果进行半定量分析。
,石蜡标本连续切片,二甲苯及梯度乙醇脱蜡至水,℃~98℃抗原修复10min,兔抗鼠胰岛素受体抗体工作浓度为1:30,4℃冰箱内湿盒过夜,染色步骤按试剂盒内说明进行,DAB显色10min。苏木素浅染细胞核,切片脱水、透明、封片。光镜下观察。
,实验结果以(x±s)表示,采用t检验,P<。
2结果
,棕黄色显色。镜下观察,胰岛素受体阳性颗粒在胰岛细胞中广泛分布,并在腺泡细胞内也有少量表达,见图1。应用Imageproplus图象分析软件进行阳性细胞核累积光密度(IOD)分析的结果表明:胰岛素受体阳性表达于1月龄最强,而后逐渐下降,至6月龄达最低,其后逐渐升高,18月龄达高峰,24月龄转而下降。统计学分析显示,6月龄组明显弱于1月龄组、18月龄组及24月龄组(P<),见表1。
*与6月龄比较,P<
-blot测定结果胰岛素受体的Western-blot测定结果显示与免疫组织化学方法相同的变化趋势,见图2。:1月龄组胰岛素受体含量最多,6月龄组胰岛素受体处于较低的水平,统计学分析显示,1月龄组、18月龄组分别与6月龄相比较,差异有统计学意义(P<),见图2。
-K的Western-blot测定结果PI3-K的Western-blot测定结果与胰岛素受体的变化趋势基本相同,见图3及图4。:1月龄组PI3-K含量最多,6月龄组PI3-K处于较低的水平,统计学分析显示,1月龄组与6月龄相比较,差异有统计学意义(P<),见表2。
*与6月龄比较,P<
3讨论
胰岛素是胰岛B细胞分泌的肽类激素,具有多种生理功能,在体内物质代谢、细胞有丝分裂中发挥重要的作用。胰岛素作用的发挥受细胞膜上胰岛素受体密度、亲和力、受体功能状态以及受体后途径等因素的影响。胰岛素受体属于受体酪氨酸激酶家族一员,与胰岛素结合后引起一系列的信号传导与放大,从而产生一系列生物效应[4]。胰岛素信号转导途径为一系列蛋白质相互作用的过程,这些蛋白按性质可分为两类,一类为酶,另一类为适配蛋白。这些信号蛋白沿着不同的信号通路向细胞内传递信息。在众多的信号通路中以PI3K途径研究得较为深入[5-6]。PI3K是一种脂质激酶,在介导胰岛素代谢效应中起关键作用。
作为分泌胰岛素的唯一组织,胰腺自身的胰岛素信号转导系统又有其特殊性。研究发现,胰岛素在胰腺外分泌系统中发挥重要作用,它通过和腺泡细胞膜上的特异性受体结合,促进腺泡细胞对葡萄糖的摄取和利用,调节胰腺腺泡的功能,增加胰淀粉酶的合成和分泌[3]。胰岛素还可有效地增加胰腺外分泌系统的胰液排出量以及HCO3-排出量[7],强化胆囊收缩素及促胰液素的刺激作用。胰岛素上述这些功能均通过PI3K来实现。随年龄增加,胰腺功能呈现退行性改变。胰腺组织的胰岛素信号分子是否受老化影响,目前还不清楚。
本研究以不同年龄段的大鼠胰腺为研究对象,观察年龄因素对胰岛素受体及其下游信号分子PI3K的影响。结果发现1月龄大鼠胰腺组织胰岛素受体含量最高,6月龄胰岛素受体含量最少,至18月龄逐渐升高,24月龄又有所下降。PI3K的变化趋势与胰岛素受体基本相同。本实验结果说明幼年大鼠处于发育不稳定阶段,胰腺处于代谢旺盛期,对能量摄取及蛋白质合成需求量大。进入青壮年,大鼠发育完善,胰岛素受体及PI3K含量下降。随年龄增加,机体内胰岛素抵抗因素增多,同时其活性下降,胰腺通过自身负反馈提高胰岛素受体数量,而细胞内PI3K不因年龄增加而减少,仍相应地增加。在大鼠衰老期,由于机体老化而导致胰岛素受体及PI3K均呈现下降趋势。1月龄组及18月龄组的胰岛素受体显著高于6月龄组。这一结果提示随年龄增加,胰腺组织对胰岛素生理功能的需求增加。
综上所述,大鼠进入成熟期后,胰腺组织的胰岛素信号传导系统随增龄显著升高。这可能与衰老所致的胰岛素抵抗有关。
参考文献
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[6]VictoriaRS,PixuL,RyoS,-KinaseinHepaticInsulinSignalingandMetabolicRegulation[J].CellMetab,2010,11(3):220-230.
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(收稿日期:2012-03-07)(收稿日期:陈丹云)
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