绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达.doc

该【绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达 】是由【Alone-丁丁】上传分享，文档一共【37】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达
背景知识
内。
实验一质粒DNA的分离与纯化
一、实验目的
掌握一种最常用的质粒DNA提取方法:碱裂解法。该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA,比较方便、省时,提取的质粒DNA质量较高,可用于DNA的酶切、PCR甚至测序。
二、基本原理
质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外,能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今为止,从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA分子,分子量范围从1kb到200kb。质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。在大多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制,因此每个细胞中只含一个或几个拷贝,称为严谨型质粒,有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严,称为松弛型质粒,它们在每个细胞中的数目可达10-200个拷贝。当宿主细胞的蛋白质合成受到抑制时(例如经
***霉素处理),细菌染色体虽不再增加,但松弛型质粒DNA可继续被复制,以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。
质粒具有一定的生物功能,它们往往带有一些抗药标记,当质粒DNA用人为的方法转化进细菌时,转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型,例如,把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后,原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表型特征,可证实质粒已转入宿主细菌中,这样就可以作为转化菌的选择性标记。
质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取,它们都包括三个基本的步骤:细菌的生长和质粒的扩增;菌体的收集裂解,质粒DNA的分离;质粒DNA的纯化。
细菌的生长和质粒的扩增
从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落,接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于松弛型质粒(如pUC系列)来说,只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期,就可以大量提取质粒,而不必选择性地扩增质粒DNA。但对于严谨型质粒(如pBR322)来说,则需在得到部分生长的细菌培养物中加入***霉素继续培养若干小时,以便对质粒进行选择性扩增。
2、菌体的收集、裂解和质粒DNA的分离
质粒分离的基本原理是利用宿主菌(一般是大肠杆菌菌株)DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异:(1)大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。(2)从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子,而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。这里主要介绍碱裂解法的基本原理:在细菌悬浮液中加入SDS(十二烷基硫酸钠)和NaOH使菌体裂解(有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁)。此处理可破坏碱基配对,故可使细菌的线状染色体DNA变性,但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时(如加入酸性的NaAc或Kac中和碱性NaOH),质粒DNA链迅速得到准确配对,重新恢复成天然的超螺旋分子。通过离心,可以使染色体DNA与变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来,而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。
3、质粒DNA的提纯
对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余蛋白质及RNA,达到纯化的目的。
质粒DNA分子具有三种构型:共价闭合环形DNA(cccDNA,SC构型)、开环DNA(OC构型)和线性分子(L构型)。在细菌体内,质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA,尽管分子量相同,但具有不同的电泳迁移率。其中走在最前沿的是SCDNA,其后依次是LDNA和OCDNA。
三、实验材料、仪器及试剂
-N3质粒的DH5α平板上菌落上挑取菌种,置于含有5mLLB培养基的试管中。摇晃过夜。
在含有pET-28a质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中,同样摇荡培养过夜。
2、使用仪器
恒温培养箱,超净台,恒温摇床,制冰机,台式离心机,小型混合器,冰箱
四、实验步骤
,13000rpm
离心1min。
重复1。
弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。
菌体沉淀重悬浮于100μL溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置10min。
加入新配制的溶液Ⅱ200μl,盖紧管口,快速温和颠倒eppendorf管5次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5min。
加入150μL预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,并倒置离心管,温和振荡3次,使沉淀混匀,冰浴中15分钟,13000rpm离心5min。
上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的***仿/异戊醇(24:1),振荡混匀,13000rpm离心2min。
将水相移入干净eppendorf管中,加入等体积的***仿/异戊醇(24:1)振荡混匀,13000rpm离心2min。
将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后,置于室温下2min,然后13000rpm离心5min。
弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1mL70%乙醇洗沉淀一次,振荡混匀后,13000rpm离心5min。
吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥。
将沉淀溶于30μLTE缓冲液(,含20μg/mLRNaseA)中,保存在-20℃冰箱中。
按照同样的流程和方法将pET-28a的质粒也提出来,保存在-20℃冰箱中。
五、实验结果
实验二质粒DNA浓度的测定
一、实验目的
学****利用核酸蛋白测定仪测算核酸的浓度和纯度。
二、基本原理
核酸分子在260nm下有最大吸光值,因此可以通过260nm下核酸的吸光值计算核酸浓度(mg/ml),并通过测定与280nm和230nm的比值,估算DNA的纯度。
三、实验材料与仪器
1、实验材料
pEGFP-N3和pET-28aDNA

Eppendorf核酸蛋白测定仪,移液枪
四、实验步骤
按下Eppendorf核酸蛋白测定仪dsDNA,比色皿中加入100μlddH2O,blank空白对照。
,吸取质粒DNA5μl,然后再加入95μlddH2O,混匀。
将100μl的溶液转移到比色皿中,注意不要出现气泡。
按下sample,记录260nm下DNA的浓度(mg/ml)。并同时记录OD260nm/280nm,OD260nm/230nm的比值,估测DNA的纯度。
计算质粒DNA母液的浓度=OD260nm下的浓度×20(mg/ml),
DNA的纯度:OD260nm/280nm=±(,说明样品中蛋白质去除的不完全,或样品中有苯酚的污染;,说明样品中RNA去除的不完全。)
OD260nm/230nm〉
实验三琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的
学****掌握一种最常用的分离、鉴定、纯化DN***段的比较方便、省时的技术:琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。