实验一淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定.doc

本科学生实验报告
学号: 124120463 姓名:
学院: 生命科学学院专业、班级: 12级生物技术班
实验课程名称: 酶工程实验一
教师: 吴倩
云南师范大学教务处编印
实验一淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定
一、目的要求
1、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法,学会应用微生物生态知识分离产酶微生物。
2、掌握淀粉酶活性测定的原理,学会淀粉酶活性的测定方法。
二、基本原理
(一)淀粉酶产生菌的分离

①要获得产生某种酶的菌种,可从富含该酶作用底物的场所去采集。
②胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致,因此要筛选具有某一特性的酶时,只要到相应的环境中采样即可。

①原理:采集到的样品中如果所需的菌很少,需要先经过富集培养,使所需的菌大量繁殖,而不需要的菌则不生长或少生长,以利于筛选。
②富集的方法:控制培养的温度、pH和营养成分等。

①淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物。
②淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖,而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物,结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈,从而筛选出淀粉酶产生菌。
(二)淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制
:根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖,还原糖与3,5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物,在一定的范围内,还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系,可利用比色法在540nm进行测定。
:、 37℃条件下,每分钟内从底物溶液中分解释放1μmol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位U/g。
酶活计算公式:酶活(U/g)=A×5×K×N×1000/(T×W)
A:样品的OD值(平均值) K:标准曲线的斜率
N:稀释倍数 5:
T:反应时间(min) 1000:转换因子1mmol=1000μmol
W:葡萄糖的分子量()
3绘制标准曲线
①先配制一系列浓度不同的标准溶液,用选定的显色剂进行显色,在一定波长下分别测定它们的吸光度A。
②以A为横坐标,浓度c为纵坐标,则得到一条拟合度较好的直线,称为标准曲线。
③然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度,便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量
三、器材
1试剂:
可溶性淀粉、碘、碘化钾、HCl、柠檬酸、Na2HPO4·12H2O等
2培养基:
分离、纯化培养基
3仪器:
①平皿、三角瓶、大试管、 1mL和10mL移液枪、涂棒;
②天平、超净工作台、培养箱、电冰箱、恒温调速摇瓶柜、离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、比色皿、记时器、高压灭菌锅。
四、操作步骤
(一)淀粉酶产生菌的分离

倒平板配制分离培养基高压灭菌30min 冷却至约50℃
倒7块平板/140mL 冷却备用

①称取土样1g,放入9mL无菌水试管中,摇动10min,静置10min,制备得到10-1土壤稀释液;
②用无菌吸管吸出1mL土壤悬液,加入盛有9mL无菌水的大试管中,充分混匀,制备得到10-2土壤稀释液;
③再从中吸出1mL加入盛有9mL无菌水的大试管中,混匀后得到10-3土壤稀释液;
④以此类推,分别制备