一代测序常见问题及解决策略.docx

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PCR常用问题
假阴性,不浮现扩增条带
PCR浮现假阴性成果,可从如下几种方面来寻找因素:
模板:①模板中有杂蛋白;②模板中有Taq酶克制剂;③在提取制备模板时丢失过多;④模板核酸变性不彻底。
酶:酶失活或反映时忘了加酶。
Mg2+浓度:Mg2+浓度过高可减少PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反映条件:变性对PCR扩增来说相称重要,如变性温度低,变性时间短,极有也许浮现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而减少特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而减少PCR扩增效率。
靶序列变异:靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。
假阳性
假阳性:浮现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整洁,亮度更高。常用因素有:
引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易浮现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种因素:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用如下措施解决:操作时应小心轻柔,避免将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR措施来减轻或消除。
浮现非特异性扩增带
PCR扩增后浮现的条带与估计的大小不一致,或大或小,或者同步浮现特异性扩增带
与非特异性扩增带。非特异性条带的浮现,其因素:一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。三是酶的质和量,往往某些来源的酶易浮现非特异条带而另一来源的酶则不浮现,酶量过多有时也会浮现非特异性扩增。其对策有:必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。减少引物量,合适增长模板量,减少循环次数。合适提高退火温度或采用二温度点法。
浮现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时浮现涂抹带或片状带或地毯样带。其因素往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:减少酶量,或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。合适减少Mg2+浓度。增长模板量,减少循环次数。
一代测序成果常用问题及分析
原始数据图片为:
图1
分析后无干扰峰的常规序列图为:
图2
常用问题有:
钉子峰
图3
产生因素:样品或毛细管内有气泡或灰尘、结晶等固体小颗粒反射激光,因此信号很高,并且所有波长(4色)均有。
解决措施:灌胶时不要产气愤泡;使用过的毛细管在取下一段时间后,重新安装前要清洗;要常常擦去灰尘;样品纯化干净。
PCR产物测序时浮现重叠峰
单一位点(图4)或两个位点(图5)的碱基缺失导致测序成果移码
图4
图5
产生因素:碱基缺失常用在PCR产物中,特别是从基因组中扩增得到的PCR片段,如上图所示,单一位点或两个位点的缺失会导致测序成果移码,影响碱基的判读。
解决方略:①将PCR产物克隆到质粒(如T载体)中挑单克隆测序,或将PCR产物进行PAGE纯化(至少琼脂糖充足电泳后切胶纯化)后再进行测序。或使用反向引物继续测序,以矫正缺失位点并达到测通的目的。②如果可以拟定该PCR片段中不应当有缺失的位点,那么可以变化PCR反映条件,重新扩增。
测序引物碱基缺失
ﻩ图6
产生因素:测序引物有碱基缺失(一般是引物的5'端缺失),和模板的碱基缺失有些类似,所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才浮现移码,而引物碱基缺失的话,则从测序一开始就浮现移码,表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。
解决方略:重新合成引物,或将引物进行PAGE纯化。
克隆测序时浮现峰形重叠
图7
产生因素:所挑选的重组子不是单克隆,所提供的测序用质粒中具有两种以上插入片段不同的质粒;或是送测序的菌液污染。
解决方略:重新挑单克隆的菌落(划线分离单菌落),提质粒或送菌液再次测序。
样品有杂合/突变位点
ﻩ图8
产生因素:范本中有杂合型突变,也就说范本自身在这个位点浮现突变;或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。如果范本有杂合突变或缺失,那么测序图形中其她的位点一般都是单一的峰形,然后忽然在某一种点浮现重叠峰(如图中箭头所示)。
解决方略:建议将DN***段克隆到载体再测序。
PolyA/T构造
图9
图10
产生因素:如图9、10所示,在PolyA/T构造浮现后,测序酶容易在模板上滑动,导致Poly A/T构造后的峰形变得杂乱,浮现移码现象。
解决方略:使用反向引物对模板进行测序,测到该poly构造处,即可完毕模板全长的拼接。
G/C特殊构造区
图11
产生因素:序列中存在一种GC特殊构造区,在该区域后,信号迅速削弱。上图的下半部分是对测序反映进行优化后的测序成果,在GC特殊构造后,测序信号得到一定限度的改善,但是离一般的测序成果还是相差甚远。
ﻩ解决方略:针对该类型的模板,一般应从反向进行测序,然后在该特殊构造区附近将两个方向的测序成果拼接起来,得到完整的序列。
基因中具有反复序列
ﻩ图12
产生因素:样品中具有反复序列导致的测序成果和Poly A/T的成果同样,会导致复制框滑动,较短的反复序列会导致测序成果浮现移码;而较长的反复序列会使信号衰减。
解决方略:反向测序有时可以顺利的通过反复序列区域(但不是一定都可以),通过多次的测序成果比对,拼接可以得到全序列成果。
背景峰杂
模板杂
图13
ﻩ产生因素:与目的片段条带大小只相差几种碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼辨别开的。但是DNA测序反映敏感而客观,可以直接反映出模板自身的状况。如上图所示,该反映的背景信号较高,不利于碱基的判读。
解决方略:变化PCR条件,重新扩增。或者可以将该PCR产物克隆到质粒中,初步筛选后进行单克隆测序。
引物不纯
图14
产生因素:引物不纯导致移码现象,与模板杂在峰图上均体现为背景峰杂,但是引物不纯在峰图上体现的更有规律,一般在每一种主峰前均有一种同一碱基的小峰。
ﻩ解决方略:重新合成引物,或者将引物进行PAGE纯化后再进行测序。
模板不单一
菌液为非单克隆