血清miR-30b、miR-199a在新生儿缺氧缺血性脑病患儿中的表达及意义.pdf

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·2963·
·论著·
血清、在新生儿缺氧缺血性
miR-30bmiR-199a
脑病患儿中的表达及意义*
杨欣,鲁利群,贺静,黄莉,汪燕
成都医学院第一附属医院儿科,四川成都
610500
摘要:目的探讨血清、在新生儿缺氧缺血性脑病()患儿中的表达及意义。
miR-30bmiR-199aHIE
方法选择年月至年月该院收治的患儿例,其中轻度组例、中度组例、重度组
2018120206HIE90293625
例,选取同期在该院出生的足月健康新生儿例作为对照组。比较各组血清、表达水平,以
30miR-30bmiR-199a
及神经功能和神经损伤指标水平。随访年,根据预后分为预后良好组和预后不良组,分析影响患儿预后
1HIE
的因素。结果随病情的加重,患儿的血清、表达水平越低(P);预后不良组的
HIEmiR-30bmiR-199a<
血清、表达水平明显低于预后良好组(P)。、是
miR-30bmiR-199a<-30b≥-199a≥
患儿不良预后的保护因素(P)。结论患儿血清、表达异常降低,其表达水平与
<-30bmiR-199a
神经损伤程度和患儿预后相关,血清、是患儿预后不良的保护因素。
miR-30b≥-199a≥
关键词:新生儿缺氧缺血性脑病;;;神经损伤;预后;危险因素
miR-30bmiR-199a
DOI中图法分类号:
:.1673-
文章编号:()文献标志码:
1673-4130202224-2963-06A
ExpressionandsignificanceofserummiR-bandmiR-ainneonatalpatients
30199
withhypoxic-ischemicencephalopathy*
YANGXin,LULiqun,HEJing,HUANGLi,WANGYan
DepartmentofPediatrics,FirstAffiliatedHospitalofChengduMedical
College,Chengdu,Sichuan,China
610500
Abstract:Objective
ToinvestigatetheexpressionandsignificanceofserummiR-30bandmiR-199ainthe
()Methods
neonatalpatientswithhypoxic-
,,
hospitalfromJanuary2018toJune2020wereselectedincluding29casesinthemildgroup36casesinthe
-termhealthynewbornsborninthis
,
-30bandmiR-199nervefunction
,
-
,
tientsweredividedintothegoodprognosisgroupandpoorprognosisgroupaccordingtotheprognosisandthe
Results

,
aggravatedtheserummiR-30bandmiR-199aexpressionlevelsintheneonatalpatientswithHIEwerelower
(P)
<-30bandmiR-199aexpressionlevelsinthepoorprognosisgroupweresignificant-
(P),
lylowerthanthoseinthegoodprognosisgroup<-30b≥-199a≥-
(P)Conclusion
tectivefactorsforpoorprognosisintheneonatalpatientswithHIE<-
,
30bandmiR-199aexpressionlevelsintheneonatalpatientswithHIEareabnormallyreducedtheirexpression
,
levelsarecorrelatedwiththenerveinjurydegreeandprognosisofthepatientsserummiR-30b≥
miR-199a≥.
Keywords:;;;;
neonatalhypoxic-ischemicencephalopathymiR-30bmiR-199anerveinjuryprogno-
;
sisriskfactors
新生儿缺氧缺血性脑病是导致新生儿死有的脑瘫患儿是由于所引起[1]目前研究
(HIE)50%HIE。
亡及神经系统发育障碍的重要因素有研究表明约发现早期对进行治疗能够改善患儿预
。,,HIEHIE
基金项目四川省科技厅应用基础研究计划项目年四川省医学青年创新科研课题
*:(2018JY0301);2021()(Q21026)。
作者简介杨欣女副主任医师主要从事儿童重症方面的研究
:,,,。
国际检验医学杂志年月第卷第期,,,
·2964·
后[2]因此寻找早期诊断的生物学标志物具有重为分离血清并将分离的血清编号保存在
,HIE12cm,,-20
要意义微小是一类具有调控功能的冰箱中
。RNA(miRNA)℃。
内源性小分子参与机体多种生理病理过122血清表达水平检测应
RNA,、..miR-30b、miR-199a
程[3]研究表明在神经系统疾用实时荧光定量聚合酶链反应检测血清
。,miR-30b、miR-199a(qRT-PCR)
病中存在异常表达与神经系统病变有密切关系[4-6]表达水平取新生儿外周静脉血
,。miR-30b、miR-199a。
神经元特异性烯醇化酶蛋白信号素血清应用法提取血清总试
(NSE)、S100B、1mL,TrizolRNA,Trizol
纤溶酶原激活物抑制剂均是剂购自美国公司生产批号应
3A(SEM3A)、-1(PAI-1)Invitrogen(20190392),
与神经系统疾病有密切关系的蛋白[7-9]但目前关于用分光光度计测量样品浓度再应用
。,TaqManRTkit
血清表达水平与患儿神经日本公司生产批号进行反转录
miR-30b、miR-199aHIE(Takara,:190284),
损伤和预后的关系鲜有报道本研究拟探讨血清提取总应用广州
。RNA。TaqManmicroRNAassay(
在患儿中的表达及意义现锐博生物公司生产批号进行扩增反应以
miR-30b、miR-199aHIE,,190528),
报道如下为内参引物序列由广州锐博有限公司合成见表
。U6,,
1资料与方法反应体系底物
2。:,TaqMan2×Uni-
11一般资料选择年月至年月本
.,TaqManmicroR-
院收治的患儿例纳入标准符合反应条件
2
HIE90。:(1),。:95
的诊断标准[10]足月出生儿胎龄周共计个循环每
;(2),37~42;(3)℃10min,95℃15s,60℃60s,45,
母体妊娠期间无严重并发症排除标准先天性个指标设置个复孔重复次完成后通过-ΔΔCt法
。:(1)33,2
颅脑畸形者伴有颅内出血者合并脑组织感计算表达水平
;(2);(3)miR-30b、miR-199a。
染者合并会影响研究结果的其他系统疾病者表各组基线资料比较
;(4)。1
根据患儿病情程度将其分为轻度组例中度组胎龄出生体质量剖宫产
29、36组别n男女nn
例重度组例另选择同期在本院出生的足月健/(/)xs周xsn
、25。(±,)(±,kg)[(%)]
康新生儿例作为对照组各组基线资料比较差异轻度组
30。2915/±±()
无统计学意义P具有可比性见表入组中度组
(>),,1。3619/±±()
新生儿家属均了解本研究内容并签署知情同意书本重度组
,2513/±±()
研究经本院伦理委员会批准对照组
。3015/±±()
12方法
χ2或F
.
121检测标本采集及保存于分娩后内采集
P
..24h

4mL,
置后以离心离心半径
10min,4000r/min10min,
表、及内参的引物序列
2miR-30bmiR-199aU6
指标正向引物反向引物
(5'-3')(5'-3')
miR-30bCGGTATCATTTGGCAGTGTCTGTGCAGGGTCCGAGGT
miR-199aAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGGGGTCATTGATGGCAACAATA
U6ATGGACTATCATATGCTTACCGTACGCTTCACAAATTTGCGTGTC
123血清蛋白水平力项肌张力项原始反射项共项总分
..NSE、S100B、SEM3A、PAI-16、8、3,20,40
检测取剩余血清中应用电化学发光法测定血分评分越高表明神经功能越好
1mL,。
清水平测定仪器为罗氏电化学125随访及预后评估所有患儿以门诊复查
NSE,ELecsys2017..HIE
发光仪试剂盒购自罗氏公司批号应用酶的形式随访年观察记录患儿神经发育情况根据
,,:180359J;1,。
联免疫吸附试验测定血清蛋白患儿预后情况将其分为预后良好组和预后不良组
S100B、SEM3A、PAI-。
水平试剂盒购自上海纪宁实业有限公司批号患儿无神经系统异常无智力缺陷为预后良好存在
1,,:、;
严格按照试剂盒说明书进脑瘫癫痫等神经系统疾病智力缺陷或死亡则为预
180719、180213、181104。、、
行操作后不良
。。
124神经功能评估于出生后应用新生儿13统计学处理采用软件进行数据分
..
项行为神经评分[11]评估所有受试新生儿析呈正态分布的计量资料以xs表示多组数据
20(NBNA)。±,
的神经功能该评分系统包括一般评估项行为能比较应用单因素方差分析两组数据比较应用t检
,3、,
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验计数资料以n表示比较采用χ2检验应用二儿完成随访失访例根据患儿预后情况将其分为
;(%),;,3,
分类转化后的趋势检验进行趋势预后良好组例预后不良组例预后不良组的
CochranArmitage60,27。
检验统计量为趋势χ2应用血清表达水平及评分明
(CochranArmitage);miR-30b、miR-199aNBNA
相关分析两变量之间的相关性应用多因素显低于预后良好组水
Pearson;,NSE、S100B、SEM3A、PAI-1
回归分析患儿不良预后的影响因素以平则明显高于预后良好组差异均有统计学意义P
LogisticHIE;,(<
P为差异有统计学意义见表
<。),6。
2结果
21各组血清表达水平及神经
.miR-30b、miR-199a
功能神经损伤指标水平比较患儿的血清
、HIE
表达水平及评分低于对
miR-30b、miR-199aNBNA
照组P趋势检验显示病情越重患儿
(<);,HIE
的血清表达水平及评分
miR-30b、miR-199aNBNA
越低P患儿的
(<)。HIENSE、S100B、SEM3A、
水平高于对照组P趋势检验显示病
PAI-1(<);
情越重患儿的水
,HIENSE、S100B、SEM3A、PAI-1
平越高P见表患儿血清
()。、。
<-
及内参扩增曲线见图扩增曲线
30b、miR-199aU6qRT-PCR1miR-30bqRT-PCR
图
1~3。
表各组血清、表达水平
3miR-30bmiR-199a
比较(xs)
±
组别n
miR-30bmiR-199a
重度组abcabc
±±
中度组abab
±±
轻度组aa
±±
对照组
±±
F

P
<<
χ2趋势检验

P趋势检验
<<
注与对照组相比aP与轻度组相比bP与中度组2miR-199aqRT-PCR
:,<;,<;
相比cP
,<。
22患儿血清表达与神经
.HIEmiR-30b、miR-199a
功能及神经损伤指标水平的相关性相关分
Pearson
析显示患儿血清表达与
,HIEmiR-30bNSE、S100B、
水平呈负相关rP与
SEM3A、PAI-1(<0,<),
评分呈正相关rP血清
NBNA(>0,<);miR-
表达与水平呈负相
199aNSE、S100B、SEM3A、PAI-1
关rP与评分呈正相关r
(<0,<),NBNA(>0,
P见表
<)。5。
不同预后患儿血清表
23
.HIEmiR-30b、miR-199a图扩增曲线
达及神经功能神经损伤指标水平比较共例患3U6qRT-PCR
、87
表各组血清神经功能及神经损伤指标水平比较(xs)
4±
组别n评分分
NSE(g/L)S100B(ng/L)SEM3A(ng/mL)PAI-1(pg/mL)NBNA()
重度组abcabcabcabcabc
±±±±±
中度组ababababab
±±±±±
轻度组aaaaa
±±±±±
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续表各组血清神经功能及神经损伤指标水平比较(xs)
4±
组别n评分分
NSE(g/L)S100B(ng/L)SEM3A(ng/mL)PAI-1(pg/mL)NBNA()
对照组
±±±±±
F

P
<<<<<
χ2趋势检验

P趋势检验
<<<<<
注与对照组相比aP与轻度组相比bP与中度组相比cP
:,<;,<;,<。
表患儿血清、表达与神经功能患儿为样本患儿的预后情况为因变量预
5HIEmiR-30bmiR-199aHIE,HIE(
及神经损伤指标水平的相关性后良好预后不良以表中差异有统计学意
=0,=1),6
义的指标为自变量并以所有患儿各指标均值
指标miR-30bmiR-199a,HIE
rPrP为临界值根据实际情况适当取整将各指标转化成
(),
二分类变量赋值见表回归采用逐表后退法
NSE--,7。,
进退回归结果显示
S100B--=,α=。:NSE≥35g/L、
SEM3A-<-<≥100ng/L、SEM3A≥45ng/mL、PAI-1≥100
是患儿预后不良的危险因素P
PAI-1-<-<(<
评分评
),miR-30b≥、miR-199a≥、NBNA
分分则是患儿预后不良的保护因素P
≥32HIE(<
见表
),7。
.HIELogistic
建立多因素非条件回归模型以本研究
Logistic,
表不同预后患儿血清、表达及神经功能、神经损伤指标水平比较(xs)
6HIEmiR-30bmiR-199a±
评分
组别nNSES100BSEM3APAI-1NBNA
miR-30bmiR-199a分
(g/L)(ng/L)(ng/mL)(pg/mL)()
预后良好组
±±±±±±±
预后不良组
±±±±±±±
t

P
<<<<
表影响患儿预后的多因素回归分析
7HIELogistic
指标赋值βSEWaldχ2POROR的CI
95%
常数
---
miR-30b≥=0,<=1-~
miR-199a≥=0,<=1-~
NSE<35g/L=0,≥35g/L=<~
S100B<100ng/L=0,≥100ng/L=<~
SEM3A<45ng/mL=0,≥45ng/mL=~
PAI-1<100pg/mL=0,≥100pg/mL=~
分分
NBNA≥32=0,<32=1-<~
注表示无数据
:-。
3讨论的负担的早期诊断并及时对患儿的神经损伤
。HIE
是导致新生儿神经系统功能障碍和残疾的程度进行判断有助于降低患儿病死率改善预后
HIE,,。
严重疾病其致残率和致死率均较高患儿常遗留共目前临床上对于的诊断主要包括颅脑超声检查
,,HIE、
济失调脑瘫癫痫和智力障碍等后遗症不仅给患儿头颅检查脑干听觉诱发电位检查及血清学检测
、、,CT、
的健康带来严重的威胁也给家庭和社会带来了沉重等[12]其中血清学检测具有操作简单诊断迅速可
,。、、
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重复观察的优点并且血清学指标的动态变化可以反评分越低表明患儿神经功能受损也逐渐
,NBNA,
映疾病发展情况受到临床医生的青睐加重
,。。
是一类单链非编码可以在组织和等[27]研究报道是
miRNARNA,KHANDELWALSEM3A
血液中稳定存在研究表明可以与靶基因的调控靶基因而等[28]报道
。,miRNAmiR-30b。LUCAPAI-1
的非编码序列结合调控基因表达[13]目前已有研是的调控靶基因本研究中患儿血
3',。miR-199a。,HIE
究发现在新生儿发生发展中存在的清表达与水平呈负相关也提示
,HIE、miRNAmiR-30bSEM3A,
异常表达影响的发展和患儿的预后[14]水平降低后可能导致其对的抑制作
,HIE。PA-miR-30bSEM3A
等[15]报道当脑组织缺氧后有种用降低导致水平升高表达与血
GACZ,23miRNA,SEM3A。miR-199a
表达上调种表达下调和清水平呈负相关则提示水平降低
、32miRNA。miR-30bmiR-PAI-1,miR-199a
均是与大脑神经功能密切相关的后可能导致其对抑制作用降低水平升
199amiRNA。PAI-1,PAI-1
等[16]研究指出可以通过调控多种蛋高促进血栓形成从而促进的发展另外
SONG,miR-30b,HIE。,HIE
白和信号通路影响大脑突触功能进而影响阿尔茨海患儿血清表达与水平呈
,miR-30bNSE、S100B、PAI-1
默病患者的认知功能并在大脑神经退行性病变的发负相关与评分呈正相关血清表
,,NBNA;miR-199a
生发展中起到重要作用与大脑神经功能达与水平呈负相关与
、。miR-199aNSE、S100B、SEM3A,NBNA
及组织缺氧有密切关系等[17]报道评分呈正相关这也提示
。TIAN,miR-199a。miR-30b、miR-199a、NSE、
具有促进血管内皮新生的功能等[18]研究指出可能共同参与了的发生
。LE,S100B、SEM3A、PAI-1HIE
下降可以引起血管内皮功能失调并导致血和发展其具体机制仍有待于今后深入研究
miR-199a,,。
流供应障碍等[19]报道当组织发生缺氧时本研究多因素分析得出
。SUN,,:NSE≥35g/L、S100B≥
表达水平显著降低引起组织中缺氧诱导因
miR-199a,100ng/L、SEM3A≥45ng/mL、PAI-1≥100pg/mL
子水平升高本研究结果发现患儿血清是患儿预后不良的危险因素P
。,HIEmiR-HIE(<),miR-
低表达并与的病情密切相关病评分分则
30b、miR-199a,HIE,30b≥、miR-199a≥、NBNA≥32
情越重患儿血清表达水平越低是患儿预后不良的保护因素P提示通
,miR-30b、miR-199a,HIE(<),
推测当发生时脑组织缺氧缺血导致过对患儿血清表达水平进
HIE,,miR-30b、HIEmiR-30b、miR-199a
水平降低可以通过调控信号通行观测可以为患儿的预后评估提供一定依据
miR-199a。miR-30b,HIE。
路影响与神经功能相关的蛋白加重神经元损伤而综上所述本研究发现患儿血清
,,,,HIEmiR-30b、
则可能通过引起血管内皮功能失调引起脑表达水平异常降低且患儿神经损伤程度越
miR-199a,miR-199a,
组织血流供应障碍加重患儿脑组织损伤严重其表达水平越低
,。。miR-30b、miR-199a、NSE、
本研究结果还发现患儿的可能共同参与了的发生
,HIENSE、S100B、S100B、SEM3A、PAI-1HIE
水平高于对照组趋势检验显示病情和发展血清的表达水平对
SEM3A、PAI-1;。miR-30b、miR-199aHIE
越重患儿的水平的诊断和预后判断具有一定参考价值
,HIENSE、S100B、SEM3A、PAI-1。
越高主要存在于神经细胞的胞质内及神经内
。NSE参考文献
分泌组织中与神经系统的增殖分化和代谢有密切
,、
关系[20]是一类特异性钙结合蛋白主要存在
[1]OORSCHOTDE,SIZEMORERJ,-
。S100B,
[]
于中枢神经系统垂体前叶细胞和星形胶质细胞中21mentofneonatalhypoxic-ischemicencephalopathywith
。
当发生时神经细胞发生缺氧损伤血清内erythropoietinalone,anderythropoietincombinedwith
HIE,,
:,,
水平升高[22]是一种以半胱氨hypothermiahistorycurrentstatusandfutureresearch
NSE、S100B。SEM3A[J].IntJMolSci,2020,21(4):1487.
酸富集区域为特征的分泌型蛋白具有调控神经轴突王萍余文发脑电图在新生儿缺氧缺血性脑病早期诊断
,[2],.
生长发育的功能[23]是一种促进血栓形成的和预后评估中的意义中国实用神经疾病杂志
、。PAI-1[J].,2016,
因子与心脑血管疾病的发生有密切关系[24]笔者推
,。19(1):66-67.
测当发生时脑血管发生缺血缺氧水平
,HIE,,PAI-1[3]CHENL,HEIKKINENL,WANGC,
升高并进一步引起脑血管内皮损伤促进微血栓形
,,developmentofmiRNAbioinformaticstools[J].Brief
[25]
成而患儿水平升高可能是一种代Bioinform,2019,20(5):1836-1852.
。HIESEM3A
偿性升高表明此时神经元受到损伤通过[4]SUS,SHAOJ,ZHAOQ,-30battenuatesneuro-
,。NBNA
评分可以了解新生儿行为能力并能早期发现颅脑损pathicpainbyregulatingvoltage-gatedsodiumchannel
,
[J].FrontMolNeurosci,2017,10(5):126.
。NBNA20,
[5]HUANGY,ZHANGS,FANGX,-
经功能受损越严重[26]本研究患儿评
。
HIENBNA199a-5pisincreasedinneutrophilicphenotypeasthma
分低于对照组趋势检验显示病情越重患儿
,,HIEpatientsandnegativelycorrelatedwithpulmonaryf