海南番木瓜提取物对D 半乳糖所致衰老模型小鼠抗衰老及学习记忆的影响.pdf

该【海南番木瓜提取物对D 半乳糖所致衰老模型小鼠抗衰老及学习记忆的影响 】是由【dt83088549】上传分享，文档一共【7】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【海南番木瓜提取物对D 半乳糖所致衰老模型小鼠抗衰老及学习记忆的影响 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。海南医学院学报2022,28(16)
JournalofHainanMedicalUniversity1207
DOI:.
网络出版地址:.
海南番木瓜提取物对D⁃半乳糖所致衰老模型小鼠抗衰老及学****记忆
的影响
熊芸雲1,周艳宁1,谢昌材1,周凯1,虞道锐2
(,,海南海口571199)
[摘要]目的:探索海南番木瓜提取物对D‑‐⁃半乳糖所致小鼠衰老模型的改善学****记忆障碍和抗衰老的
作用。方法:将水迷宫实验筛选认知能力正常的4月龄昆明种小鼠共72只,根据随机平均原则,分为阴性对
照组、模型组、吡拉西坦组以及海南番木瓜提取物高、中、低剂量组(400、200、100mg/kg),共6组,每组12
只,海南番木瓜提取物与吡拉西坦组每天以灌胃给药途径给予以上药物,阴性对照与模型两个组以同样的
%NaCl溶液。各组小鼠每周称重1次;给药的同时,每天用2%D‑‐⁃半乳糖对除阴性对
照组小鼠外各组小鼠进行腹腔注射,%NaCl溶液,共7周。49d后,通过Morris水
迷宫观察小鼠的空间学****记忆能力;后取各组小鼠脑组织分别检测其超氧化物歧化酶(Superoxide
Dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、一氧化氮合酶(Nitric
oxidesynthase,NOS)的含量;以HE染色法观察海马组织病理学的改变,Westernblot测定脑组织核因
子‑‐⁃E2‑‐⁃相关因子(Nrf2)蛋白表达水平。结果:海南番木瓜提取物干预衰老模型小鼠后,其高、中、低剂量组可
不同程度地缩短小鼠的游泳时间和游泳距离,同时能升高小鼠脑组织SOD、CAT、NOS活力和降低MDA
含量;且高剂量组表现最佳,优于吡拉西坦组(P<);同时能通过减少神经元细胞核固缩来改善小鼠海
马组织中神经元组织病理学改变,并能呈剂量依赖性提高小鼠脑组织中Nrf2蛋白的表达。结论:海南番木
瓜一定程度上有延缓D‑‐⁃半乳糖所致亚急性衰老小鼠的各项体征,具有一定的抗衰老的作用,其作用可能与
Nrf2信号通路有一定的联系。
[关键词]海南番木瓜提取物;D‑‐⁃半乳糖;抗衰老;认知障碍。
[中图分类号][文献标识码]A[文章编号]1007-1237(2022)16-1207-07
TheHainanpapayaextract’seffectonanti⁃aging,learningandmemoryofagingmodel
miceinducedbyD⁃galactose
XIONGYun‑‐⁃yun1,ZHOUYan‑‐⁃ning1,XIEChang‑‐⁃cai1,ZHOUKai1,YUDao‑‐⁃rui2
(,Haikou571199,China;,
HainanMedicalUniversity,Haikou571199,China)
[FoundationProject]:2017HainanMedicalCollegeStudentInnovationandEntrepreneurshipTrainingProgram(HYCX2018093)
[Author]:XIONGYun‑⁃yun,E‑⁃mail:******@.
[Correspondenceto]:YUDao‑⁃rui,SeniorExperimenter,E‑⁃mail:******@.
Received:2022‑⁃03‑⁃30Revised:2022‑⁃05‑⁃21JHMU,2022;28(16):1207‑‐⁃1213
Viewfromspecialist:Itiscreative,andofcertainscientificandeducationalvalue.
[ABSTRACT]Objective:ToexploretheeffectsofHainanpapayaextractonlearningandmemoryimpairmentandanti‑‐⁃aging
inD‑‐⁃galactose‑‐⁃:Atotalof72Kunmingmicewithnormalcognitiveabilityscreenedbywatermazetest
wererandomlydividedintonegativecontrolgroup,modelgroup,piracetamgroup,high,mediumandlowdosegroupsofHainan
papayaextract(400mg/kg,200mg/kg,100mg/kg),
[基金项目]2017年海南医学院大学生创新创业训练计划项目(HYCX2018093)
[作者简介]熊芸雲,E‑‐⁃mail:******@。
[通讯作者]虞道锐,高级实验师,E‑‐⁃mail:******@。
[收稿日期]2022‑‐⁃03‑‐⁃30[修回日期]2022‑‐⁃05‑‐⁃21网络出版时间:2022‑‐⁃05‑‐⁃2614:43:15

weregiventheabovedrugsbygavageeveryday,%Na‑‐⁃
;Atthesametime,exceptforthenegativecontrol
group,miceineachgroupwereintraperitoneallyinjectedwith2%D‑‐⁃galactoseeveryday,andthenegativecontrolgroupwasintra‑‐⁃
,Weobservedeachgroupofmice’scapacityoflearningand
memorybyMorriswatermazebehavioraltest;Then,thecontentofsuperoxidedismutase(SOD),malondialdehyde(MDA),
catalase(CAT),andnitricoxidesynthase(NOS)weremeasured;Ontheotherhand,weobservedthehippocampus’histopatho‑‐⁃
logicalchangesbyhematoxylin‑‐⁃eosinstaining,andmeasuredtheproteinexpressionofnuclearfactor‑‐⁃E2‑‐⁃relatedfactor(Nrf2)in
:AftertheinterventionofHainanpapayaextractonagingmodelmice,
thehigh,mediumandlowdosegroupscouldshortentheswimmingtimeandswimmingdistanceofmicetovaryingdegrees,in‑‐⁃
creasetheactivitiesofSOD,CATandNOSinmousebraintissueandreducethecontentofMDA,Theperformanceofhighdose
groupwasbetterthanpiracetamgroup(P<).Atthesametime,itcanimprovethehistopathologicalchangesofneuronsin
mousehippocampusbyreducingneuronalnuclearpyknosis,andincreasetheexpressionofNrf2proteininmousebrainina
dose‑‐⁃:Hainanpapayaextractisabletopostponevariousphysicalsignsofsubacuteagingmice
causedbyD‑‐⁃galactose,andpossessesdefiniteanti‑‐⁃agingandantioxidanteffects,whichmayberelatedtotheregulationofNrf2sig‑‐⁃
nalpathway.
[KEYWORDS]Hainanpapayaextract;D‑‐⁃galactose;Anti‑‐⁃aging;Cognitiveimpairment
社会生活与经济水平的提高,人口老龄化的日抗衰老作用,为海南番木瓜在抗衰老方面提供实验
益增加,衰老后带来了许多疾病是现代社会医学所支持。
重点关注的问题,至此,当代科学界的热门研究问1材料与方法
、药物及仪器
的生活水平[1]。衰老是机体随着增龄各种器官功能吡拉西坦,批号:190705,购自广东华南药业集
的普遍削弱而发生退行性改变,其中涉及了多因团有限公司;D‑‐⁃半乳糖,批号:G0625,购自Sigma公
素、多器官等复杂过程,它具有慢性的不可逆性特司;海南番木瓜提取物,由海南医学院生药学教研
性,导致衰老的主要原因是自由基的产生,氧自由室提供;%的NaCl溶液配置成400、200、100
基代谢失衡[2,3]。脑作为人体重要器官,受衰老的影mg/kg的药液。3个剂量组的剂量按市售木瓜粉中
响也非常大,表现为免疫力下降和寿命缩短以及学人体服用剂量2倍量递增;[超氧化物歧化酶(super‑‐⁃多,但对于延缓衰老的机制尚未清楚,亦缺乏有效CAT),批号:20180118;一氧化氮合酶(nitricoxide
延缓的药物,因此探讨衰老机理及研发有效延缓衰synthase,NOS)批号:20180432、丙二醛(malondial‑‐⁃
老的药物,从而改善老年人的生活质量具有重要dehyde,MDA)批号:20180275]试剂盒,均购自南京
意义[5‑‐⁃7]。建成生物工程研究所;anti‑‐⁃核因子‑‐⁃E2‑‐⁃相关因子
D‑‐⁃半乳糖常用于构建衰老动物模型,其效应已(nuclearfactorerythroid‑‐⁃derivedfactor2‑‐⁃related
经得到了国内外研究者的认可,并且D‑‐⁃半乳糖已大fac‑‐⁃tor,Nrf2),批号:ab137550,购自Abcam公司;
范围应用于抗衰老药物研究[8]。有文献表明[9]D‑‐⁃半Morris水迷宫装置,购自成都泰盟科技有限公司。
乳糖诱导的衰老模型的程度与16~24个月大的正生物素化羊抗兔IgG(1∶500),购自Sigma公司;
常小鼠相似,并且这些变化与自然衰老相一致。番Mini‑‐⁃PROTEANTetra垂直电泳转印系统,购自
木瓜(Caricapapaya)属番木瓜科又称木瓜[10]。主Bio‑‐⁃Rad公司;WesternBlot自动分析仪,购自pro‑‐⁃
要分布在热带、亚热带[11]。目前有研究表明,番木teinsimple公司。
瓜具有很多生物活性,包括抑菌、抗氧化抗炎、
菌、抗癌、镇痛等[12‑‐⁃14]。最新研究发现番木瓜具有抗实验小鼠72只,体重18~25g,昆明种清洁级,
氧化性、能有效地清除自由基等多种生物活性[15]。长沙天勤生物技术有限公司购置,各组小鼠均室温
然而针对海南番木瓜能否延缓衰老的研究进度较分笼喂养,并让其自由饮水进食。本实验动物研究
为落后,且具体延缓机制尚未明了。因此,本实验参海南医学院伦理委员会的标准,遵循“3R”实验设
以亚急性衰老小鼠模型探索海南番木瓜提取物的计原则,在实验过程中尽可能给动物在舒适的环境
‑‐⁃半乳糖所致衰老模型小鼠抗衰老及学****记忆的影响1209
中完成,规范操作实验步骤以减轻实验动物的痛匀成浆状,放入低温离心机中,调至4℃,离心15
苦,实验结束后动物以***的方法处死,最后委min(转速:3000r/min),离心结束后,取出上清液,
托学校动物管理中心处理所有动物尸体。动物合按说明书进行下一步操作,测其SOD、NOS、
格证号:SCXK(湘)2014‑‐⁃001。MDA、CAT各自的含量。

室温下,让小鼠自由饮水、摄食,适应性喂养1将保存于‑‐⁃80℃冰箱的另一半海马组织取出后
周,再通过水迷宫试验[16]先训练后筛选认知功能将其剪碎,并按要求将其与RIPA裂解液、PMSF
正常的72只小鼠作为正式实验。再将其随机分成蛋白酶抑制剂混合研磨并制成匀浆,低温裂解30
阳性对照组、阴性对照组、模型组和海南番木瓜提min左右,下一步离心40min(转速:12000r/min),
取物高、中、低剂量组,每组12只小鼠。海南番木取其上清液蛋白定量,将计算好的上样量与缓冲液
瓜提取物高、中、低剂量组(400、200、100mg/kg)和混合、摇匀,100℃水煮10min。上样40μg的蛋白
阳性对照组(600mg/kg)的小鼠灌胃给药;其余两样品进行电泳分离,然后转膜封闭1h,并在4℃冰
%NaCl。同时,阴性对照组腹箱中一抗孵育过夜,第2天二抗37℃孵育1h于
%NaCl100mg·kg-1·d-1,其余各组通ECL发光液中显色,结束后进行曝光和拍照,此处
过腹腔注射给药2%D‑‐⁃半乳糖140mg/kg。用此方利用凝胶图像处理系统处理,最后分析并与内参条
法连续给药进行7周,每周将进行一次称重,根据带比较灰度值。
体重调整其用药量,7周后进行后续试验。

第7周后小鼠进行2d适应性训练,训练内容计学处理;计量资料的表示采用(xˉ±s);组间差异
为将小鼠放置于终点旁水域,小鼠自行找到平台并的比较采用方差分析;两两比较用两独立样本t检
爬上台阶2次为准,第3天开始测试,数据作为记忆验,P<。
成绩。各组小鼠分上、下午两个时间段,大池平均2结果
分4个象征限并标记,将小鼠面向水池壁,
不同的标记点放入水,同时记录其游泳距离、逃避给药第15天开始,对比模型组和对照组,小鼠
潜伏期,以90s内找到平台为准,若超过90s未找的毛色枯黄、无光泽并伴有脱毛,且出现行动迟缓、
到平台,测试者再引导小鼠休息在平台后撤出水精神萎靡、摄食明显变小等行为。而第28天后,海
池,以90s作为其潜伏期。重复实验间隔不少于南番木瓜提取物高、中、低各剂量组才出现脱毛现
30min,连续实验4d后撤除平台,接着在任意1个象,但第42天后脱毛量逐渐减少,且毛色、光泽等
入水点再让小鼠面向池壁入水,记录其游泳方面有很大的改善。
时间[17]。

小鼠经Morris水迷宫实验后,颈椎脱臼处死后第1天水迷宫实验中,各组间的游泳时间比
取其大脑,%NaCl较,差异无统计学意义(P>)。从第3天起,模
水溶液洗净、滤纸吸干,取出海马组织,将海马组织型组小鼠的游泳时间明显长于阴性对照组,差异具
对半切为两片,将一半海马组织放置于冷冻柜中−有统计学意义(P<)。而海南番木瓜提取物各
80℃保存,以备后期Nrf2蛋白表达测定的使用;另剂量组与模型组比较,游泳时间均随着实验时间的
一半则4%甲醛固定,HE染色观察脑组织形态学增加而呈剂量依赖性缩短趋势,第4天时,海南番
变化。剩下的脑组织放置于冷冻柜−20℃保存,用木瓜提取物各剂量组比模型组游泳时间明显减少,
于脑组织SOD、CAT、NOS、MDA的含量检测。差异具有统计学意义(P<);与模型组比较,
、NOS、MDA、CAT的含吡拉西坦组游泳时间明显减少,差异具有统计学意
量检测义(P<),但高于高剂量组,提示海南番木瓜提
将4℃%NaCl溶液加入事先取材保存的小取物在一定范围内提高记忆能力优于吡拉西坦,
鼠脑组织,以脑重量体积比1∶9的量置于匀浆管中见表1。

表1海南番木瓜提取物对衰老模型小鼠水迷宫游泳时间的变化(s,n=12,xˉ±s)
Tab1Effectsofhainanpapayaextractonswimmingtimeinwatermazeinagingmice(s,n=12,xˉ±s)
剂量游泳时间
组别
(mg/kg)第1天第2天第3天第4天
阴性对照组-±±±±
模型组-±±±#±##
±±±*±**
±±±±*
±±±*±*
±±*±*±**
注:与阴性对照组比较,#P<,##P<;与模型组比较,*P<,**P<。
,海南番木瓜提取物高剂量组游泳
迷宫游泳距离的影响距离缩短最明显,第4天时,海南番木瓜提取物中、
第1天水迷宫实验中,各组游泳距离比较,差异高剂量组游泳距离明显短于模型组游泳距离,差异
无统计学意义(P>)。从第2天起,模型组游泳具有统计学意义(P<);吡拉西坦组也明显缩
距离明显长于阴性对照组,差异具有统计学意义(P短,但略高于高剂量组,差异具有统计学意义(P<
<)。与模型组比较,),见表2。
量组的游泳距离均随着实验时间的延长而呈剂量
表2海南番木瓜提取物对衰老模型小鼠水迷宫试验游泳距离的变化(m,n=12,xˉ±s)
Tab2Effectsofhainanpapayaextractonswimmingdistanceofagingmodelmiceinwatermazetest(m,n=12,xˉ±s)
剂量游泳距离
组别
(mg/kg)第1天第2天第3天第4天
阴性对照组-±±±±
模型组-±±#±##±##
±±±*±**
±±±±
±±±*±*
±±*±**±**
注:与阴性对照组比较,#P<,##P<;与模型组比较,*P<,**P<。
、NOS、CAT、
变化形态的改变
与阴性对照组比较,模型组SOD、NOS、CATHE染色结果中:图1A(阴性对照组)中海马组
含量明显降低,而MDA含量明显升高,说明模型制织可见正常的CA1区神经细胞,细胞间排列整齐;
备成功。与模型组比较,海南番木瓜提取物各剂量图1B(模型组)中海马组织可见CA1区神经细胞变
组呈剂量依赖性逆转衰老模型的SOD、NOS、性坏死现象明显,部分细胞的体积变大、胞浆深染,
CAT、MDA的含量,且随着剂量增加而效果增强,神经元核固缩且轴突消失,细胞膜核膜界限不够清
其中高剂量组效果最强,差异均具有统计学意义(P晰且细胞数量有所减少;图1C(吡拉西坦组)中海马
<),在提升SOD含量和降低MDA水平方面优组织可见CA1区神经细胞的形态有好转趋势;图
于吡拉西坦组,提示海南番木瓜可能通过调节这两1D(海南番木瓜提取物低剂量组)中海马组织可见
个活性水平来提高学****记忆能力,见表3。CA1区神经细胞变性、坏死、数量减少,但较模型组
‑‐⁃半乳糖所致衰老模型小鼠抗衰老及学****记忆的影响1211
表3海南番木瓜提取物对衰老模型小鼠脑组织中SOD、NOS、CAT、MDA含量的影响(n=12,xˉ±s)
Tab3EffectsofpapayahainanensisextractonSOD,NOS,CATandMDAcontentsinbraintissueofagingmodelmice(n=12,xˉ±s)
剂量SODNOSCATMDA
组别
(mg/kg)(U/mg)(U/mgprot)(U/mg)(nmol/mg)
阴性对照组-±±±±
模型组-±##±##±##±##
±**±*±**±**
±*±*±*±
±*±**±*±*
±**±**±**±**
注:与阴性对照组比较,#P<,##P<;与模型组比较,*P<,**P<。
轻;图1E、F(海南番木瓜提取物中、高剂量组)中海好,其改善程度有一定的剂量依赖性。提示海南番
马组织CA1区神经细胞变性坏死的程度较轻且数木瓜提取物可能通过保护海马CA1区神经细胞来
量略减少,细胞膜核膜界限清晰好多,高剂量组较延缓衰老和提高记忆。
A:阴性对照组;B:模型组;C:吡拉西坦组;D:海南番木瓜提取物(100mg/kg)组;E:海南番木瓜提取物(200mg/kg)组;F:海南番木瓜提取物
(400mg/kg)组
图1海南番木瓜提取物对D‑‐⁃半乳糖所致衰老模型小鼠海马组织形态的影响(HE×400)
Fig1Effectsofhainanpapayaextractonhippocampalmorphologyofd⁃‑galactoseinducedagingmice(HE×400)
(P<);而海
Nrf2蛋白表达的影响南番木瓜提取物低、中、高剂量给药组脑组织中
免疫蛋白印迹结果显示,与阴性对照组比较,Nrf2蛋白表达均呈剂量依赖性趋势升高,差异有统
模型组脑组织中Nrf2蛋白表达明显降低,差异具有计学意义(P<),且上升幅度与阳性药吡拉西坦
统计学意义(P<);与模型组比较,吡拉西坦组组持平。见图2。

A:阴性对照组;B:模型组;C:海南番木瓜提取物(100mg/kg)组;D:海南番木瓜提取物(200mg/kg)组;E:海南番木瓜提取物(400mg/kg)组;
F:吡拉西坦组。与阴性对照组比较,#P<,##P<;与模型组比较,*P<,**P<
图2海南番木瓜提取物对衰老模型小鼠脑组织脑组织Nrf2蛋白表达的影响
Fig2EffectsofpapayahainanensisextractonNrf2proteinexpressioninbraintissueofagingmodelmice
3讨论来保护身体各脏器由自由基引发的损伤,从而有抗
目前,老龄化现象逐渐加重,衰老及之后带来衰老作用[22]。本研究结果表明海南番木瓜提取物
的许多问题引起了人们的重视。虽然衰老是一种各剂量组能够很大程度提高衰老小鼠脑组织中的
正常生理现象,但若发展太快,将使NS带来病理性CAT的活性,且与吡拉西坦组相当。
的如AD、PD的退行性病变,给患者与其家人造成反应神经认知和治疗效果评估的水迷宫试验
严重的经济损失[18]。如果长期摄入D‑‐⁃半乳糖,会使是目前常用的实验手段[23],本研究结果显示,海南
代谢紊乱,之后再累及到各器官、系统,使其正常功番木瓜提取物各剂量小鼠在逃避潜伏期和游泳探
能降低。包括记忆力减退、免疫器官退化,体力明索距离方面有明显的减少,提示海南番木瓜提取物
显不支等症状,而体内无形中有自由基的堆积和过能改善衰老模型小鼠的神经认知功能障碍。小鼠
氧化脂质、脂褐质均增高,细胞膜脂质从而受损,继脑海马组织形态学也进一步表明了海南番木瓜提
而增高体内的B型单***氧化酶活性等。以上的改变取物高、中、低浓度组都在不同程度上改善神经细
都与高龄小鼠类似。胞结构。有研究表明,Nrf2是抗氧化的因子,其下
机体内超氧化物歧化酶的活性在衰老中占主游的各种抗氧化酶被激活后发挥抗氧化应激损伤,
要因素,机体随着超氧化物歧化酶活性提升意味着间接延缓衰老[24,25]。本研究结果提示,海南番木瓜
清除自由基的能力会加强。降解产物丙二醛又是能上调Nrf2蛋白表达的水平,说明间接上调与其相
在自由基作用下产生的,细胞损伤程度随着MDA关的抗氧化酶的含量,来增加体内的抗氧化能力,
含量升高而增大。因此两者含量的多少,直接影响使其能够延缓衰老的效果。
到机体衰老,是衡量衰老的重要指标。本研究结果本研究通过海南番木瓜提取物对D‑‐⁃半乳糖所
显示,海南番木瓜提取物各剂量组以一定的趋势提致衰老模型小鼠的干预,发现其具有一定的提高记
高SOD活性及降低MDA水平,这表明其有助于增忆效果,并在一定程度上能改善神经认知功能和海
强机体对自由基的清除能力而大大减少组织细胞马组织的病理改变,其作用机制可能是有效的提升
损伤程度,因此可能通过其起延缓衰老作用[19,20]。脑组织中SOD、NOS、CAT的含量并降低MDA的
NO是一种小分子物质,有着多种生物活性,不但提水平,进而增加Nrf2蛋白活性以抗氧化作用去改善
高机体学****记忆能力,而且作用于神经系统介导神小鼠的学****记忆能力,为临床开发用药