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含抗凋亡基因bcl
【摘要】 目的:构建并鉴定含鼠bcl-2基因重组逆转录病毒。方法:将抗凋趼亡基因bcl-2片段从载体中切下,定蓰向插入逆转录病毒载体PLNCX2中,√酶切鉴定;脂质体法将重组逆转录病毒转嘉入包装细胞系PT67,G418筛选建掉立稳定表达bcl-2的细胞株。结果:灾双酶切鉴定,成功构建重组逆转录病毒载体;重组逆转录病毒转入包装细胞PT6鳆7,经G418筛选,形成了抗性克隆,钽并测得病毒滴度为3×1011cfu/帑L,提示构建的含鼠bcl-2基因重组俯逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论:-2重组逆转录病毒载体构建成岂功。
【关键词】 逆转录病毒载体重组疳bcl-2基因
  0引言
随着一些常见致盲眼病已有较好的防治措施,难治骷性或不可治性眼病已成为眼科研究的热点媾和焦点。难治性眼病主要是指一些累及视按网膜的变性性疾病,如遗传性视网膜变性垅、老年性黄斑变性、视网膜色素上皮细胞鲢和锥杆细胞的渐进性变性死亡,迄今尚无放防止这些细胞变性死亡的有效方法。我们爪构建抗凋亡基因bcl-2重组逆转录病拶毒,将其导入培养的正常的SD大鼠RPE细胞,然后将其显微注射入视网膜色素腑变性鼠的视网膜下腔,对视网膜变性性疾┡
病基因治疗进行探索性研究,为构建并鉴证定bcl-2基因重组逆转录病毒的工作旺报道如下。
 1材料和方法
材料 P巍LNCX2逆转录病毒载体和包装细胞系首PT67为第二军医大学微生物教研室潘卫提供,含鼠bcl-2基因的)由中国科学院细胞生化所刘新垣教授惠赠,质粒Π提取试剂盒和DNA纯化回收试剂盒均购髯于上海博彩生物科技有限公司;TOP1魔0F’和DH5α大肠杆菌菌株由微生物啜教研室提供,以CaCl2方法制成感受┓态细胞;各种限制性内切酶及pMD18郎T载体购于TaKaRa宝生工程;NIH3T3细胞、脂质体及G418均购自瘘Clontech公司;琼脂糖及各种生盟化制剂购于上海华舜生物工程公司产品。点
方法 ①的扩增:将小鼠质粒用CaC牮L2方法转入大肠杆菌TOP10F′菌赕株中,LB培养基扩增,碱裂解法提取质黼粒DNA,并用Wizard质粒提取试陋剂盒加以纯化质粒DNA。②设计和合成T引物,上游5′-ATAAAGCTTAGGGAGA-痼3′,下游5′-AGGTA-﹄3′,由上海生工生物工程公司合成。P马CR扩增:50μL体系中,模板DNA辔1μL,dNTP1μL,引物上游5′热-GGGAGA-3′,下游5′耪-AGGTA-3′各1μL,芡TaqBuffer5μL,Taq酶1弛μL,在PCR仪(2400型,美国P
岣E公司)扩增,94℃5min后94℃30s,55℃30s,72℃50s,半35循环,72℃7min,4℃10min。扩增PCR产物序列分析 扩增得到的DNA电泳,低融点胶回收纯化。按诣Promega操作手册连接插入pGE璜M-T载体后转化到感受器DH5α大肠杆菌中,筛选出含有bcl-2目的基因掩质粒的菌落,提取酶切鉴定后,命名为p有GEM-bcl-2。将所选出含有目的基因质粒的大肠杆菌送上海基康公司进行数测序。用限制性内切酶HindⅢ和St去uⅠ酶解质粒pGEM-bcl-2,电黏泳、低融点胶回收小鼠bcl-2DNA翳片段,溶解于TE中,-20℃保存。逆泽转录病毒载体PLNCX2,用限