总糖和还原糖的测定及葡萄糖标准曲线的绘制3,5-二硝基水杨酸法PPT课件.ppt

实验一、总糖和还原糖的测定 ——3,5-二硝基水杨酸法
一、实验目的
1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理;
2、学****用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法。
二、实验原理
还原糖是指含有自由醛基或者***基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖;利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来;对没有还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
NaOH
黄色
棕红色
加热
在过量的NaOH碱性溶液中, 3-氨基-5-硝基水杨酸呈橘红色,在540nm处有最大吸收,在一定的浓度范围内,还原糖的量与光吸收值成线性关系。利用比色法,在540nm 波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
三、实验器材
1、材料:山芋粉
2、仪器:电子分析天平、水浴锅、V-1100可见分光光度计、移液器
3、其他:试管、容量瓶、三角烧瓶、量筒、吸管(移液管)、洗耳球、玻棒、洗瓶、漏斗、离心管、六凹反应盘、pH试纸(1~14)
四、实验试剂
1、标准葡萄糖溶液()
2、DNS试剂
3、6mol/L HCl
4、6mol/L NaOH
5、I2-KI溶液
五、操作
1、样品中还原糖的提取

加3ml蒸馏水,调成糊状
再加30ml蒸馏水
50℃水浴,30min (不时搅拌)
转移至50ml离心管中,4000rpm,5min
上清液1
沉淀
加20ml蒸馏水,洗涤沉淀,4000rpm,5min
上清液2
沉淀(弃)
置于容量瓶中,蒸馏水定容至100ml,混匀,取1ml即可进行还原糖的测定。
2、样品中总糖的水解、提取

加3ml蒸馏水,调成糊状
再加12ml蒸馏水,5ml 6mol/L HCl
沸水浴,30min (不时搅拌)
取1~2滴于六凹反应盘中,加1滴I2-KI溶液,如果完全不显蓝色,即可进行下面的操作。
冷却至室温
用6mol/L ( pH试纸)
蒸馏水定容至100ml,混匀
滤纸过滤,取10ml滤液用蒸馏水定容至100ml,成稀释1000倍的总糖水解液,混匀,取1ml总糖水解液,测定其还原糖的含量
3、制作葡萄糖标准曲线及还原糖、总糖含量的测定。
取8支洁净的试管,分别用记号笔标上0~7号,按照下表进行操作。其中0~5管,用于标准曲线的制作,以吸光度为纵坐标,各标准液浓度(mg/ml)为横坐标作图得标准曲线(用Excel表制作)。