分子生物学课件.ppt

聚合酶链式反应(PCR技术)
PCR基本原理
PCR是在体外进行的DNA复制反应,基本原理和过程与体内DNA的复制相似。
每一次复制包括3个步骤:变性、退火、延伸。
变性:使DNA双螺旋结构的氢键断裂而形成两条单链DNA分子作为PCR反应的模板。
退火:使引物与模板DNA序列互补结合,形成杂交链。
延伸:按照碱基配对的原则依次把dNTP加至引物的3′端,在DNA聚合酶的作用下,生成新的DNA双链。
5`
3`
5`
3`
35℃
95℃
55℃
72℃
PCR基本原理
PCR原理
请注意引物结合的位置
一、PCR的扩增体系:
模板:单链DNA分子
引物:化学合成的寡核苷酸,决定PCR扩增产物的特异性。
引物需分别设在被扩增目的片段的双侧两端,并分别与模板正负链碱基序列互补。长度一般以18~30个核苷酸为宜。
两条引物之间(尤其在3‘-OH末端)的序列不能有互补,否则会形成引物二聚体。
脱氧核苷三磷酸:dATP、dCTP、dGTP、dTTP的混合物,各种核苷酸的浓度必须一致。
Taq DNA聚合酶:催化DNA合成,使DNA链沿5’→3’方向延伸。
此外,镁离子浓度、缓冲液等对PCR反应的重要作用。
二、PCR的扩增条件:
温度:PCR三个步骤所需的温度是不同的。
变性温度一般在95~97℃之间,使DNA双链完全打开。
退火温度的设定取决于引物的Tm,通常PCR的退火温度应低于引物Tm 5℃左右。
延伸温度一般为72℃, Taq DNA聚合酶具有较高的催化活性。
时间:PCR循环中每个步骤所需的时间取决于所扩增片段的长度。在模板进行第一次变性时应给予足够长的时间,使模板彻底变性,再进入循环。
退火时间主要取决于引物长度,而延伸时间则主要取决于扩增产物的长度。
以200~1000bp的扩增片段为例,循环中变性、退火和延伸三个步骤的持续时间一般为30~60秒。
循环次数:循环次数是PCR反应的一个重要参数,一般为20~40次。虽然PCR产物呈指数性增长,但是这种增长形式在扩增20~25个循环后开始放慢,很快达到反应平台,因此,PCR扩增效率呈S型曲线。
平台出现的迟早与模板初始量有关,反应体系中模板初始量越多,平台出现得越早。
实时荧光定量PCR(real-time PCR、qPCR)
所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。