草鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定.doc

草鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定.doc草鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定
:郝贵杰, 沈锦玉, 徐洋, 姚嘉贇, 潘晓艺
【摘要】目的: 研制抗草鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体(mAb)并进行免疫学特性分析。方法: 制备草鱼免疫球蛋白IgM, 以其为抗原免疫8周龄雌性BALB/c小鼠, 3~4次免疫后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合, 用ELISA法对杂交瘤进行筛选, 并鉴定mAb的生物学特性。结果: 各株阳性克隆经3次亚克隆后, 共获得5株抗草鱼IgM的mAbs, 分别命名为4B3、 2B11、 4D5、 3F2和4E6, 它们的细胞上清ELISA效价为1∶3 200~1∶6 400, 其中4D5的细胞上清及腹水效价分别为1∶6 400和1∶256 000, 经亚类鉴定结果表明5株mAb均为IgG1。交叉反应结果表明5株mAb均不与台湾甲鱼、泰国甲鱼、日本甲鱼和中华鳖的血清反应, 除mAb 4B3外, 其余4株均与草鱼、青鱼、鲢鱼、鳊鱼和花鱼骨的血清有明显的交叉反应, 而与鲫鱼、鳗鱼的血清只有微弱的反应。mAb 4B3只与草鱼和青鱼的血清有反应, 而与其他鱼类血清反应很弱。免疫印迹实验结果表明mAb 4D5能在变性条件下识别草鱼IgM的重链。ELISA检测mAb 4D5对草鱼IgM的敏感性达10 μg/L。结论: 制备的抗草鱼IgM mAb可用于草鱼免疫球蛋白的结构分析、免疫应答水平监测和病原诊断等, 具有广阔的应用前景。
【关键词】免疫球蛋白; 间接ELISA; 单克隆抗体; BALB/c小鼠
草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是一种草食性鱼类, 饲养成本低, 养殖地域广, 具有悠久的养殖历史, 是我国四大家鱼之一, 其养殖对我国农业经济增长具有重要的意义[1]。但草鱼病害一直困扰该产业的发展, 尤其是草鱼出血病危害最为严重, 常引起草鱼鱼种及成鱼的大批死亡。要解决这些问题, 除了加强管理、提高养殖技术外, 还必须重视其病原学、免疫学等领域的研究, 将免疫预防手段引入到草鱼养殖业, 通过免疫手段有效增强鱼体主动防御能力, 减少疾病的发生机率[2]。然而对草鱼免疫学的研究还处于初始状态, 王欣欣等[3]克隆并分析了草鱼免疫球蛋白分子重链cDNA的一些特性。李亚南[4]进行了嗜水产气单胞菌诱导的草鱼免疫球蛋白的分析, 得出草鱼的免疫球蛋白主要是IgM, 其单体的重链和轻链相对分子质量(Mr)分别为62 000和26 000。但未见到草鱼免疫球蛋白单克隆抗体(mAb)的研制和应用的报道。基于这种认识和生产上的需求, 我们开展了草鱼免疫球蛋白mAb的研究, 试图将mAb运用于草鱼Ig结构与功能的分析以及病原诊断学和免疫应答规律的研究。
1 材料和方法
材料草鱼体重1 000~1 500 g, 购自湖州某农贸市场。8周龄雌性BALB/c小鼠及ICR小鼠购自浙江大学医学院实验动物中心。HT、 HAT及高糖型DMEM购自Sigma公司; 小牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司。L谷氨酰***(LG)购自上海实生细胞生物技术有限公司。辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自华美生物工程有限公司。融合用PEG4000购自Sigma公司, 邻苯二***(OPD)购自华美公司, 其他生化试剂均为国产分析纯试剂。
方法
免疫原的