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糖尿病肾病血瘀证大鼠铁死亡相关基因GPX4、ACSL4表达水平变化.pdf


文档分类:医学/心理学 | 页数:约7页 举报非法文档有奖
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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。万方数据糖尿病肾病血瘀证大鼠铁死亡相关基因、泶锼奖浠韩佳瑞,彭紫凝跹б,邢玉凤清趸劾,庞欣欣糖尿病肾病珼糖尿病常见的微血管并发症之一,其发病率高达%~%,也是导致终末期肾脏病的重要病因随着糖尿病患病率在世界范围内的上升,姆病率也在逐年增加的发病机制复杂,可能由多种因素共同作用导致,包括遗传因素、高血压、炎症反应、糖脂代谢紊乱等D壳傲俅采螪的防治方法主要有控制血糖、血压、血脂等方式,同时注重维生素、矿物质补充治疗等,可减轻患者的部分临床症状,但是尚无针对闹苯佑行У闹疗方法‘。晒槭粲谥幸窖А跋省薄八住钡确冻搿缙谟胂世嗨疲锶壬艘酰孀偶膊》⒄梗伤气,气阴两虚,气虚则血失推动,阴虚则脉道涩滞,血行不利,发为血瘀证Qp鲋す岽〥病程始终,且临床上应用具有活血化瘀功效的药物能够明显抑制筟。铁死亡是新近发现的一种铁依赖性的调节性细胞死亡方式,其特征是铁离子依赖的脂质过氧化物和活性氧自由基增多L劳鲋惫鄣谋碚魑O吡体皱缩和线粒体膜密度增加L劳鍪芏嘀只调控,机制复杂,主要涉及铁稳态和脂质过氧化代谢等方面,在肾脏疾病的进展中发挥重要作用?。血瘀证铁死亡程度是否更加严重,是否是加重肾损伤的重要因素,这是本研究关注的重点。材料动物选取缎坌許笫唬周龄,初始体质量河诤幽鲜∈笛槎镏心砜芍ず牛篠豫皇褂眯砜证号:—8瓒锉曜脊庹周期、适宜室内温度和湿度ァ,给予大鼠灭菌饮用水、灭菌饲料。本次实验遵循“”原则,并获得河南省中医院伦理委员会审查批准谋号:—一—。主要药物、试剂%大分子右旋糖酐暇糖,批号:北京索莱宝科技有限公司;链脲佐菌素琒、.河南中医药大学第二临床医学院,河南郑州;幽鲜≈幸皆荷霾】疲幽现V丶蔧糖尿病肾病;血瘀证;铁死亡;;基金项目:河南省中医药科学研究专项重点课题作者简介:韩佳瑞,女,博士,教授,硕士研究生导师通信作者:庞欣欣,男,博士,副主任医师,硕士研究://.、p鲋ぷ椤2捎酶骨蛔⑸淞措遄艟氐姆椒ǜ粗笫竽P停捎梦簿猜鲎⑸溆倚囚姆椒ǜ粗艱血瘀证模型。实验过程中观察大鼠血瘀证表现及检测虻鞍住⒀G寮◆⒀D蛩氐!⒀R毫鞅溲е副辏捎盟漳揪灰梁烊旧ā旧ā染色观察肾脏的组织形态,采用透射电子显微镜观察铁死亡典型细胞的线粒体变化;采用免疫组织化学法、法检测肾组织铁死亡相关蛋白ち歹ヵ8窤合成酶珹⒐入赘肽过氧化物酶珿吧鲈嘞宋副闧纤维连接蛋白,徒涸白,谋泶锼健=峁与对照组比较,榇笫笊鲈嗖±肀浠又兀吡L逅鹕嗣显,虻鞍缀浚G寮◆⒀D蛩氐K郊叭pざ取⒀=、和Ⅳ。p鲋大鼠出现唇色黯淡、眼球黯红、耳廓紫红、舌下脉络紫黯等血瘀证表现,虻鞍缀脱G寮◆⒀D蛩氐K矫飨高于椋庋晕⒕迪驴杉鲈喑鱿置飨缘南的せ试錾⑸鲂∏蛭酢⑸黾渲式涸粱拖宋缱酉晕镜下可见肾组织细胞线粒体损伤明显,嵴基本断裂,—。结论p鲋ご笫笊鲈嗨鸷更加严重,其机制可能与、..—...蝗ü幸揭┐葱鹿歉扇瞬排嘌钅浚缓幽省中医药拔尖人才培养项目专项课题生导师,⑺漳揪灰梁猠,旧约梁、高碘酸一无色品红—琍旧菏约梁旧约梁:北京索莱宝科技有限公司;白蛋白测定试剂盒—、肌酐测定试剂盒⒛蛩氐2舛ㄊ约梁—:南京建成生物工程研究所;纤维连接蛋白現⒊ち歹ヵ8窤合成酶珹徒涸鞍珻一Ⅳ荷虾贸易有限公司;内参患《鞍猘一⒐入赘肽过氧化物酶—籰、抗鼠/兔通用型免疫组织化学检测试剂盒何浜喝ド锛际跤邢薰尽主要仪器电泳仪转膜仪⒛荷描成像系统好拦止荆惶视显微镜喝毡綨公司。动物模型的复制、分组及干预措施将只大鼠作为对照组,其余只大鼠按腹腔注射芤海周后测量血糖水平。其间对照组脱落唬P痛笫笾只大鼠血糖未达到标准被剔除。第周时以虻鞍缀俊作为笫竽P透粗瞥晒Φ谋曜迹峁不竦只P痛笫螅渌婊骄治狣组和p鲋ぷ椤0凑×痥亮浚璐鼠尾静脉注射%大分子右旋糖酐,共巍T诮行第挝簿猜鲎⑸浜蠹涓蠼械次注射,然后禁食,⒋讲俊耳廓的润泽程度,眼球、爪掌、舌下脉络的红润程度,尾根静脉的隐显情况。.笫笊龉δ堋虻鞍准觳各组大鼠处死前占蛞海捎冒椎鞍撞舛ㄊ约梁测定虻鞍缀俊4笫笤诖λ狼俺铺逯柿俊⒔食ニ下热┞樽硐戮劭艟猜霾裳#采血后痬离心掷胙G澹直鹩尿素氮测定试剂盒、肌酐测定试剂盒测定血尿素氮,和血清肌酐,水平。大鼠血液流变性检测①血浆黏度检测。按/剂量腹腔注射%戊巴比妥麻醉大鼠,从腹主动脉取血,掷血浆,使用全自动血液流变仪检测血浆黏度。②全血黏度检测。取用肝素抗凝的全血,置于全自动血液流变仪内,分别测量高、中、低切变率下的全血黏度。肾脏组织形态观察将大鼠肾组织固定、包埋、切片,切片厚度痻荻纫掖纪阉该鞣馄分别进行、、旧ǎ庋晕⒕迪鹿鄄各组肾脏的组织形态学变化。对大鼠肾脏进行穿刺,制备成纳鲎橹椋℃下采用潭ㄒ固定,采用透射电子显微镜观察线粒体形态并拍照。免疫组织化学法检测肾组织蛋白表达水平取大鼠肾组织,石蜡切片,脱蜡后采用:封闭,微波炉修复,山羊血清封闭,分别滴加适量一抗:℃过夜,复温后加入山羊抗兔/鼠以标记聚合物,孵育后,滴加旌弦喝色,~笾罩狗从Γ漳揪ǜ慈荆9嫱阉明,封片,在妒右肮庋晕⒕迪鹿鄄焐鲎橹、、鞍妆泶锼健2捎肐版本:;ǖ鞍滋醮叶戎怠法检测肾组织中、猯、鞍妆泶锼采用裂解液提取总蛋白,ń械鞍锥浚捎聚丙烯酰***凝胶进行电泳分离,转膜,封闭后加入一抗籥:娣跤梗琓次,每次尤攵杂的二抗,孵育后洗危看⒐庖显色曝光,采用砑刑醮叶壬并分析。—觳馍鲎橹疐—、、表达水平在肾组织样本中加入试剂,提取总≧纯度和浓度,进行反转录,采用┰鯢和蚱巍R訥作为内参基因,按试剂盒说明书设置反应体系及参数。反应条件:℃,9鲅贰A觳庥ü獠⒓锹祭增曲线,采用样点拟合法分析结果,得到目的基因和腃,值,以D诓危法计算目的基因的相对表达水平。目的基因引物序方法/:、虎:://.’—珿狟、:、、:、妫妫℃,..万方数据蒽·翥壬一聪蛞镂聪蛞镂,,采用魍肌<屏孔柿喜用“均数±标准差荨纒苯型臣蒲枋觥6嘧榫数比较采用完全随机设计的单因素方差分析。苫2钜煊型臣蒲б庖濉榇笫笠话阕纯觥⑸龉δ堋液流变性比较对照组大鼠皮毛、唇部、耳廓润泽,眼球、爪掌、舌下脉络红润,尾根静脉隐显;大鼠皮毛润泽,唇色、眼球、爪掌略黯,耳廓暗红,舌下脉络紫黯,尾根静脉隐显;p鲋ぷ榇笫笃毛欠润泽,唇色黯淡,眼球黯红,耳廓紫红,舌下脉络紫黯,爪掌水肿略黯,尾根静脉隐显。与对照组比较,榇笫骃、虻鞍住尿素氮水平及全血黏度、;p鲋ぷ榇笫骃、全血黏度、血浆黏度显著高于。榇笫笊鲈嘧橹翁冉螲现铁死亡特征性改变,部分线粒体嵴紊乱、断裂,其旧ń峁允径哉兆榇笫笊鲂」堋⑸鲂∏蛭双层膜密度增高,部分伴有线粒体外膜断裂;明显病理变化,肾脏组织基本正常。染色结果血瘀证组大鼠。肾脏线粒体明显变小,线粒体嵴发生显示:榇笫笥忻飨缘南的せ试錾蜕鲂∏断裂或消失。见图萎缩,p鲋ぷ橄的せ试錾蜕鲂∏蛭跽榇笫蟆I鲎橹疓、、虎舻体加重。染色结果显示:榇笫笊鲎白表达水平比较免疫组织化学染色结果显示,对织间隙可见蓝色胶原纤维,出现蓝色胶原物沉积,产照组中大鼠肾组织中在肾小球、肾小管中表生纤维化;p鲋ぷ槔渡ǔ粱C飨裕宋化严重。旧ń峁允荆篋组大鼠。肾组织量表达;与对照组比较,榇笫驡谏鲂有大量淋巴细胞浸润,病变程度较为严重,表现为紫球、肾小管中表达水平降低,见少量棕黄色颗粒沉红色;p鲋ご笫笊鲎橹虾焐ǚ植几飨裕积,饕T谏鲂」鼙泶铮糠肿鼗粕n?帕#有大量糖原物质积累。见图主要在肾小球表达,见少量黄褐色颗粒物沉积;榇笫笊鲎橹⒔峁贡冉电子显微镜主要在肾小球基底膜处表达,有少量棕黄色颗下可见:对照组大鼠肾组织线粒体嵴排列整齐,无明粒沉积。与楸冉希珼血瘀证组大鼠显肿胀、变白等损伤性病变;榇笫蟆I鲎橹Ⅳ的阳性表达更加明显,颜色加深。歹篏正向引物为籉恼蛞镂,的正向引物为籄的正向引物为琠聪蛞镂采用皇结果虻鞍缀脱虻鞍住水平及见图达明显,。Ⅳ在肾小管、肾小球中少://.—一籆琠琠组别三图榇笫笊龉δ堋虻鞍缀脱R毫鞅湫员冉孑±.∽万方数据擎旱籌上辫邈≯泌誓。戬·#海靛妻邸矧鼍唬杭海.≯。谢M跚迦稳衔p鲅N8髦旨膊〉牟∫颍骸叭私灾榇笫笊鲎橹庖咦橹旧ń峁、图法定量检测蛋白表达水平的结果见图⑼,免疫组织化学法和法检测结果均显示:与对照组比较,、、虎舻鞍妆泶锼矫飨陨;与组比较,、、,榇表达水平显著降低表达水平显著升高%;〉难现夭⒎⒅⒅唬ァ的突型糖尿病患者会发展为以ず蟛百病生于气,而不知血为百病之始也”。熬貌人络”,脾肾气虚,血不能载气生气,血液停留而致瘀血,为“因虚致瘀”。瘀血阻滞,临床表现以舌瘀紫、脉涩、舌下脉络变黯等为主。《金匮要略·惊悸吐衄下血胸满瘀血病脉证治第十六》中有云:“口干燥而渴??,其脉反无热,此为阴伏,是瘀血也。”《金匮要略·水气病脉证并治第十四》云:“血不利则为水。”《灵枢·五变》指出:“人之善病消瘅者,何以候之蚱夏妫刂行罨F媪簦牌こ肌,血脉不行,转而为热,热则消肌肤,故为消瘅。”认为瘀血是消瘅发病的重要原因。颊叨嗨潴留,代谢失衡,气机阻遏导致经脉不通,发为瘀血。有学者现代研究指出,近年血瘀证与活血化瘀的研究较多,表明血瘀证发病广泛,其中F浼发的关键疾病”。因此,瘀血是⒉〖安』演变的关键环节。榇笫笊鲎橹疓、、鼠肾组织,—.<。讨论://.—旧玃染色注:;黑色箭头示线粒体嵴形态电子显微镜下榇笫笊鲎橹翁删ぃ!:。’图。.知。●吒!,●。,万方数据喜一一一熬一麓蠹澎嚆美秽≤雾鬻■■■■●—瘛,●●—◆猑●——瘛馹荽蕊罗熬%’啊啊薄瘛觥觥觥!觥觥!缙谒鹕酥饕1硐治I鲂∏蚍蚀螅的で细胞外基质,聚集,高糖等病理环境能够使肾小管到馐艿揭种疲期多表现为肾小球、肾小管间质纤维化。其中饕S山涸鞍缀头墙涸鞍鬃槌桑丶蛋白猯虵S醒芯靠凇砻鳎悄虿』颊在高糖、蛋白尿等多种因素的作用下,引发肾小管上皮细胞结构和功能发生损伤,进而诱发肾脏纤维化,直接导致肾功能恶化,粱勺魑7从成龉δ下降严重程度和判断预后的重要指标,抑制沉积相关通路能够减轻盏嫉腄模型大鼠‘冬篆’.’●■■—■■—■://.:,。.;、、舯泶锼奖冉纒,”一表达水平比较庖咦橹旧ǎ注:哉兆椋瓺组;瓺血瘀证组法检测榇笫笊鲎橹表达水平组另绀别沣:,.;与楸冉希%浚簐相对表达水平比较纒,籪#、、.寸列、寸。凸:工ⅰ万方数据笔虿复肾组织的纤维化,从而抑制幕酆虴的转化,延缓埂1狙芯拷峁允荆篋大鼠肾脏、及其表达水平较对照组明显升高,且、、旧ń峁允旧鲎橹鱿置飨病理变化,水平明显升高,表明笫笊损害严重;p鲋ご笫笠陨媳浠螪组更为明显。以上结果提示,p鲋ご笫笊鲈郋沉积,出现肾脏纤维化,肾损伤加重。铁死亡特征有两大方面:一是在细胞形态方面,铁死亡会导致细胞线粒体变小,膜密度增高,嵴减少,而细胞核中形态变化不明显;二是细胞成分方面,铁死亡表现为铁依赖性脂质活性氧的异常增加所引起的氧化还原稳态失衡,还包含一些特征基因发生变化1局噬咸劳鍪怯捎谙赴谥恃趸物自身代谢发生障碍,即由于的活性下降,钚陨撸贾轮恃趸锊荒鼙淮晃N氧化毒性物质,进而在二价铁离子作用下以芬顿反应的方式催化,导致细胞内铁的大量沉积,严重破坏细胞内氧化还原平衡,攻击生物大分子,触发细胞死亡,引发肾脏疾病等多系统疾病口。目前,与铁死亡相关的基因主要包括抑制铁死亡的基因和促进铁死亡的基因F中基因是一种抑制铁死亡基因,是还原毒性过氧化物的关键酶,其可防止脂质过氧化物的毒性,保持膜脂双层稳态,是铁死亡关键抗氧化因子;—蚰芄淮俳嗖槐ズ椭舅岱⑸使趸参与磷脂酰乙醇***和磷脂酰肌醇等易氧化膜磷脂的合成,促进铁死亡发生。等研究表明,∈筇劳鱿喙乇昙俏颎虯发生显著变化,且种萍聊芄挥糜贒治疗,首次证实铁死亡与芮邢喙亍S醒芯靠诿髦实,与/∈笊鲈嘞啾龋琩痙∈笊鲈嘀幸种铁死亡因子等表达水平明显降低,铁死亡可能通过缺氧诱导因子通路增强鏊鹕恕本研究结果显示:盏嫉腄大鼠肾脏线粒体形态发生显著变化,且p鲋ご笫笊脏线粒体明显变小,线粒体嵴发生断裂或消失;笫笊鲈郃蛋白及其表达水平显著增加,蛋白及其表达水平显著降低;且与楸冉希珼血瘀证大鼠肾脏—捌鋗泶锼矫飨陨撸珿鞍准其表达水平明显降低。结果提示,鼠肾组织有铁死亡发生,且血瘀证促进铁死亡,导致肾损伤更加严重。本研究结果与丁阳等叩研究结果相似,即活血化瘀药物能够明显改善∈氧化应激反应,增加的表达水平,抑制铁死亡水平,缓解肾损伤。综上所述,血瘀证为暮诵牟』p鲋纳鏊鹕烁友现兀浠瓶赡苡隚榈嫉奶劳鲇泄亍1狙芯靠晌;钛;鲆┪通过抑制铁死亡治疗峁┦笛橐谰荨苍旨谛×郑芮浚粤只#龋悄虿∩霾〉闹幸奖嬷尉期糖尿病肾病例临床观察泄幸交∫窖г残拢模砉幔龋例临床期糖尿病肾病患://.:与对照组比较,.;与楸冉希榇笫笊鲎橹疓、、狪相对表达水平比较±币参考文献:∩霾》⒉』’肾病杂志,,狧:谢V幸揭┰又荆:.簦氡O眨讣鸭眩龋嫫趸钛M绶ㄖ瘟圃志,,者中医证候聚类分析谢V幸揭┭—甌簍—,,.《量寸。《.:.琫:,田金洲,王永炎,,鞠建庆,林骞,,/:/瓼丁阳,∩霾〉,弧.://.甧..安徽中医药大学学报第卷第月.,,:—.甴://畂/./较及评价泄幸交∫窖г又荆:甆琈谢I鲈嗖≡又荆—琒瓻:—甴://畂/./甧琖/卜/,,:.海畂/./...崭迦掌冢,琙,,...篴琗.:,:琑琫.——,,:—..,—!:.:.琎琒,.,.—,,,.—猺籧,甴琣現琣:,,—籬,;琯:;;鬳籅;籊籄琇..琘珺珼一,甊瑃瑂瑃

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