不同抗原表位CART-30细胞对经典型霍奇金淋巴瘤细胞株的杀伤作用及优化研究.pdf

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使用AnnexinV-PE,避光室温孵育15min,5μL7-Amino-的一抗和二抗为:鼠源IκBαIgG抗体(1∶3000,康Actinomycin(7-AAD)染液孵育15min,加入400μL为世纪,中国)、兔源P-NFκBIgG抗体(1∶3000,1×bindingbuffer混匀,应用流式细胞仪检测细胞凋康为世纪,中国)、兔源p65IgG抗体(1∶3000,康亡情况。AnnexinV-PE阳性显示在细胞早期凋亡阶段为世纪,中国)、山羊抗鼠IgG-HRP(1∶3000,康因细胞膜破坏而被染色,7-AAD阳性显示细胞凋亡晚为世纪,中国)、山羊抗兔抗体(1∶3000,康为世期阶段、正在坏死及已经死亡。早期凋亡和晚期凋纪,中国)。亡均认为杀伤阳性。-Ki-4-CAR及PWPT-Ber-H2-(IBM公司,美国):..·602·癌症2023年第42卷第11期进行数据处理,正态分布的计量资料以平均值±凋亡情况,其中早期凋亡及晚期凋亡部分均为阳性标准差()表示,组间比较采用t检验,多组间被杀伤细胞。如图3所示,CD30-CART细胞能够特比较采用单因素ANOVA分析。认为P<。以CIK细胞杀伤cHL统计学意义。细胞系作为空白对照组(图3A);Ki-4组效靶比为1∶1时杀伤效率的平均值为(±)%(n=2结果6,图3B),效靶比为10∶1时杀伤效率的平均值为(±)%(n=6,图3C);Ber--GFP质粒转染cHL细胞的情况为1∶1时杀伤效率的平均值为(±)%(n=因CD30特异性表达于cHL细胞表面,优化构建6,图3D),效靶比为10∶1时杀伤效率的平均值为不同抗原表位的CD30-CART细胞,可为cHL的免疫(±)%(n=6,图3E);CD19组效靶比治疗提供新的思路和方法。我们选择了对细胞毒性为1∶1时杀伤效率的平均值为(±)%(n=最低且转染后细胞可稳定增殖的pWPT载体。我们6,图3F),效靶比为10∶1时杀伤效率的平均值为将CAR-GFP质粒转染入293T细胞后,在荧光显微镜(±)%(n=6,图3G);CIK组效靶比为下通过观察GFP荧光显影(图1),检测转染效率,1∶1时杀伤效率的平均值为(±)%(n=%,95%%–6,图3H),效靶比为10∶%。(±)%(n=6,图3I)。-GFPCART细胞阳性表达率及不同效靶比的杀伤效应均P<,差异有统计本研究在杀伤前(第10–12d)通过流式细胞术学意义(表2)。以上结果表明,不同抗原表位的检测细胞GFP表达率,以此来测定细胞目的基因的整CD30-CART细胞对cHL细胞杀伤效率不同。合率。12个平行实验组的pWPT-GFP--30细胞对cHL细胞NF-κB通阳性率见表1,CD30-CARs感染阳性率的95%%–%(表1,图2)。-GFP感染阳性率(%,)图1荧光显微镜下观察293T细胞转染CAR-GFP质粒48h后荧光蛋白表达情况:..癌症2023年第42卷第11期·603·图2流式细胞术检测pWPT-GFP-CART细胞表达阳性率ABCDEFGHI图3流式细胞术检测不同效靶比时L428细胞凋亡情况:..·604·癌症2023年第42卷第11期表2各平行实验组CAR-GFP感染阳性率(%,)WB实验结果显示,TNF-α组及Ki-4的2h、3h组面,在正常细胞中鲜有表达[4,5]。目前,靶向CD30的磷酸化P65呈强阳性,IκBα蛋白呈弱阳性;而空白对CAR-T细胞免疫治疗在临床治疗中已获得一定疗效,照组、Ki-4的0h组及Ber-H2各组磷酸化P65及IκBα蛋白但疗效仍有待进一步提高。均呈现弱阳性(图4)。以上结果提示,杀伤效应与本研究采用慢病毒法对CIK细胞进行转染,但CD30-CARs与cHL细胞表面CD30结合程度及结合持续慢病毒对人原代T细胞有一定的毒性,转染时我们采时间呈正相关,也与CARs能否激活NF-κB相关。用使用不同病毒滴度以避免不良反应,并达到最佳感染效率。我们检测了霍奇金淋巴瘤细胞株L428的3讨论免疫分型,显示其CD30表达阳性,CD19表达阴性(结果本文未列出),因此,选用CART-19作为空载经典霍奇金淋巴瘤是一种起源于淋巴造血系统对照组,未携带目的基因的载体转染的CIK细胞作为的恶性肿瘤,主要发生于年轻和老年患者[2,13]。目阴性对照组。杀伤效率实验结果显示Ki-4组>Ber-H2前,常规化疗疗效较好,但约14%的R/RcHL患者预组>对照组,表明针对CART-30杀伤作用的优化实后仍较差[3,4]。如何减少并发症、优化和个体化治疗验成功;CART细胞组靶向性及杀伤作用等优势好于是当前研究的重点。近年来,CAR-T细胞治疗成为免CIK细胞组。疫治疗研究的热点。CD30特异性表达于cHL细胞表有研究[14]认为Ber-H2不能激活NF-κB,但Ber-图4蛋白质免疫印记检测携带两种不同质粒的293T细胞与L428细胞共同培养不同时间后磷酸化P65及IκBα的表达情况:..癌症2023年第42卷第11期·605·H2-CARs和Ki-4-CARs能否激活NF-κB通路尚不明同意发表确。NF-κB是一种调节转录因子,由P65和P50两个亚单位组成不同形式的同源或异源二聚体[14]。在静无需。息状态下,IκBα、P65及P50均以失活状态存在于细胞质。CD30的高表达可通过与TNFRs相互作用激伦理批准和同意参与活IκK,活化的IκK可泛素化、磷酸化并降解IκBα,对P65及P50的抑制作用减弱,从而激活P65及P50。无需。活化的P65和P50可启动特异的靶基因(如细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、免疫受体、参考文献急性蛋白等)转录,影响肿瘤的形成,促进cHL细胞的转化、增殖及活性。若构建的CD30-,NatalieSGrover,AnneWBeaven,Premal活NF-κB通路,则可为临床中NF-κB抑制剂硼替佐米DLulla,WuMF,AnastasiaIvanova,-CD30CAR-(bortizomine)联合CART-30免疫治疗来提高R/;38(32):3794–。;;10(9):-α能够有效激活NF-κB通路,故选用TNF-,NityaGulati,AudreyMauguen,激后的L428细胞与未转染质粒的等量293T细胞共培MichaelJAbsalon,SharonMCastellino,。binationbrentuximabvedotinandbendamustineforpediatricpatientswithrelapsed/refractoryhodgkinKi-4的scFv能有效激活NF-κB,但Ber-H2-;5(24):5519–-κB。本研究结果为硼替佐米增强CART-,。changingfaceoftherelapsed/;24(11):1477–,-;134(7):591–、实验操作、,WangXM,GengHZ,LiTC,LiDS,ZhangBP,,张苗参与了课题设计及数据整理,齐Anti-PD-1therapyenhancestheefficacyofCD30-directed霄参与了实验操作及部分文章撰写,邱鸣寒和杨臻chimericantigenreceptorTcelltherapyinpatientswith参与了数据整理及文章撰写,王华庆指导了课题设relapsed/refractoryCD30+、文章撰写及校对工作。所有作者均阅读并同意2022;13:。,FarrahT,:activation,costimulation,;76(6):959–,EmersonRO,SherwoodAM,DesmaraisC,ChungM-W,ParsonsJM,。;4(1):1–,MasonDY,GerdesJ,O’ConnorN,WainscoatJ,PallesenG,’sdiseaseassociatedantigenKi-1inreactiveandneoplasticlymphoid本研究中使用和/或分析的数据集可通过合理要tissue:evidencethatReed-Sternbergcellsandhistiocytic求从通讯作者处获得。:..·606·,SethLilly,:;66:848–;,(1):34–;35(4):968–-;,DmitryAOvchinnikov,MarcusLHastie,21(23):,JeffreyJGorman,(收稿:2023-07-15接受:2023-10-17发表:2023-11-20),2015;26(5):993–,HinrichHansen,FriederikeHeuck,KatrinReiners,Citethisarticleas:邹丹丹,张苗,齐霄,邱鸣寒,杨臻,王PeterBorchmann,AchimRothe,-30细胞对经典型霍奇金anti-CD30antibody5F11activatesNF-;lymphomacellstobortezomib-(11):599–;106(5):1839–42.