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高聚合度异麦芽寡糖的制备及体外益生功能评价.pdf


文档分类:医学/心理学 | 页数:约9页 举报非法文档有奖
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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。万方数据高聚合度异麦芽寡糖的制备及体外益生功能评价许滢唬王蕾唬魏贝贝宿玲恰唬吴敬陈晟唬?,兀坞翨?,摘要:异麦芽寡糖琁瞧咸烟且詏,擒占V髁佣傻牡聚糖,具有低血糖指数特征和益生菌增殖功能。目前商业化髁髦票腹ひ盏寐式系停液大量异麦芽糖,而囊嫔δ苤饕9楣τ谌羌耙陨系母呔酆隙茸榉帧煤谇来源的一葡萄糖苷酶和嗜热脂肪芽孢杆菌来源的环糊精葡萄糖基转移酶进行复配制备曰竦玫寐屎途酆隙忍嵘腎狪“Müヒ蛩厥笛椋疾炝朔从⑽露取⑹奔洹⒌孜镏掷嗉凹用一葡萄糖苷酶量对产物得率的影响,随后探究了复配酶加酶量及反应时间的影响,结果表明在、。姆从μ跫拢疞的值为~的麦芽糊精为底物,一葡萄糖苷酶加酶量为痝缘孜镏柿考、加酶量为痝缘孜镏柿考时,产物得率达到.%,其中三糖及以上的高聚合度产物质量分数为.%。.%,平均相对分子质量为哂谑惺跧。通过肠道微生物体外发酵实验,坝胧惺跧相较,对青春双歧杆菌更具有增殖效果,同时可以进一步抑制肠道条件致病菌大肠杆菌的生长,具有一定的体外益生功能。该研究提出了一种双酶复配制备男鹿ひ眨9ひ抵票父叩寐省⒏呔酆隙鹊腎提供了新思路。关键词:异麦芽寡糖;~葡萄糖苷酶;环糊精葡萄糖基转移酶:制备工艺:益生功能中图分类号:文章编号:—一—痠..—...‘琖,,.食品科学与技术国家重点实验室江南大学,江苏无锡:江南大学生物工程学院,江苏无锡籕兀珻.,:一,甌畐甀琌基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目;国家自然科学基金重点项目:国家自然科学基金面上项目ㄐ抛髡撸何饩┦浚淌冢┦垦芯可际Γ饕4邮旅腹こ逃敕⒔,,.琂收稿日期:——。万方数据组分的生成及稳定湖。环糊精葡萄糖基转移酶甀甌遜异麦芽寡糖琁葡萄糖以仅一糖苷键为主连接而成的低聚糖混合物,主要成分为异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖及四糖以上的低聚糖。鸲热岷停腿饶退幔侵数低,是一种良好的低热量甜味剂,同时具有降低血清胆固醇含量、改善肠道微生物环境等益生效益S捎谄溆帕嫉睦砘灾始吧砉δ埽琁被广泛应用于功能性食品及医药保健品行业中,拥有巨大的市场需求量。天然饕4嬖谟谖多帷⒒凭频确⒔褪称中,并以游离状态微量存在于红薯、木薯等淀粉作物中。由于天然提取成本高且工艺复杂,目前市售饕R揽棵阜ㄉ酆隙,蟾旁~V髁鞯墓ひ抵票椒ㄊ且缘矸壑试衔5孜铮揽俊耙坏矸勖讣启一淀粉酶等将淀粉液化、糖化,生成以麦芽糖为主的低聚合度寡糖混合物,再结合一葡萄糖苷酶的转苷作用生成具有一糖苷键的复杂寡糖混合物圈,该方法制备寐镏柿坑氲孜镏柿康比话阍ァィ次J惺鄣腎,其主要成分为异麦芽糖、异麦芽三糖和潘糖。然而,研究表明,囊嫔δ苤饕9楣τ谌羌耙陨系母呔合度组分【ΑA硪恢稚绞绞且哉崽俏5孜镌料,使用葡聚糖蔗糖酶珼合成右旋糖酐,再通过右旋糖酐酶珼作用水解生产,这种生产方法可通过调控底物浓度及、使用比例来调整产物聚合度,但由于生产原料蔗糖成本较高,且该方法只能利用蔗糖中的葡萄糖单元,理论得率不超过%,不适用于工业化生产。易子玲等通过将一葡萄糖基转移酶和普鲁兰酶、异普鲁兰酶、异麦芽三糖右旋糖酐酶复配,以淀粉为底物可制备高纯度异麦芽三糖,,但是该法存在使用复配酶种类多、工艺复杂等问题。因此,如何在低原料成本的基础上,开发简易新工艺,提升产品得率及聚合度是高效制备饕9タ说哪烟狻一葡萄糖苷酶依靠转移单个葡萄糖基生成浞从砭龆瞬镏饕<形6恰⑷等低组分。在催化转苷反应的同时,黄咸烟擒酶还会进行水解反应,形成大量葡萄糖,不利于高属于糖基水解酶家族及“一淀粉酶家族,可发生肿\辗从歧化反应、环化反应、偶,瑃瑂眗.%,瑃许滢,等:高聚合度异麦芽寡糖的制备及体外益生功能评价—琣..%℃.疞產痝瑆,【.:,—琧琾琾万方数据联反应耙恢炙夥从Γ渲衅缁从ξ7肿游转苷反应。不同于“一葡萄糖苷酶,能以直链麦芽低聚糖为供体咸烟恰⒙笱刻堑刃》肿犹作为受体。呋肿游首\辗从Γ哂刑岣呤芴逦定性、改善理化性质等作用?5逼湟灾绷炊嗵俏9体和葡萄糖、麦芽糖等为受体时,可以生产得到线性寡糖混合物,进而提高淀粉制糖体系底物利用率。针对瞪鶬的问题,在以往制备主要用酶黄咸烟擒彰的基础上,复配使用了,提出一种以麦芽糊精为底物,通过使用黑曲霉来源的一葡萄糖苷酶复配嗜热脂肪芽孢杆菌来源的制备男路椒ǎ庵炙酶复配法制备的聚合度提高的狪通过单因素实验结合双酶复配对酶转化条件进行了优化,包括、温度、反应时问、加酶量、底物种类、复配酶加酶量及复配酶反应时间等,,对产物结构如相对分子质量、链长分布、键型比例进行测定分析,同时通过体外肠道微生物的发酵对产品的益生效果进行评价。与市售冉希父磁渲票傅腎“中一糖苷键键型占比更高,平均相对分子质量更大,益生效果更好。材料与试剂菌株与质粒毕赤酵母、长双歧杆菌莎⑶啻双歧杆菌⒋蟪Ω司⒕、具有畇丛吹幕泛咸烟腔R泼基因的质粒2赜谧髡所在实验室。.牧嫌胧约麦芽糊精:菏泽天邦生物制品有限公司产品:商业化异麦芽寡糖荷蕉ò龙生物有限公司产品;高温“一淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、普鲁兰酶:山东隆大生物逃邢薰静罚酵母粉、胰蛋白胨:英国静罚慌H饨郏美国公司产品:异麦芽糖、潘糖、异麦芽二糖标准品:日本公司产品;其他试剂国产分析纯荷虾9┘挪贰仪器与设备液相色谱系统、—色谱柱:安捷伦科技有限公司产品:高效凝胶排阻色谱仪:美国怀雅特技术公司产品:,字⒗胱由滓牵好拦晒司产品:全数字化核磁共振波谱仪:德国布鲁克公司产品:厌氧髡荆河⒐览程┛⑸锘∨嘌疞旱鞍胨,酵母粉,.半胱氨酸盐酸盐,胆盐,吐温嘌疞旱鞍纂,酵母粉,,柠檬酸氢二铵,乙酸钠吐温。其余培养基为培养大肠杆菌及毕赤酵母常用培养基:、、扰养基。一葡萄糖苷酶及酶液的制备为宿主,对黄咸烟擒彰富蚪斜K拗鳎訡蚪行表达。,即得至应粗酶液。.富盍Σ舛ā耙黄咸烟擒彰缸\彰富盍υ/宜嵋灰宜崮苹撼逡褐胁舛ǎ缓冲液中溶有疞的麦芽糖溶液。在℃下,以麦芽糖溶液为底物,加入稀释一定倍数的酶液,精确反应后煮沸灭酶。体系中转苷生成的异麦芽糖、异麦芽三糖、潘糖含量南测定。酶活力定义:在上述条件下,将每分钟催化转續葡萄糖基所需的酶量定义为一个酶活力单位。的歧化酶活力测定方法参考文献中的āC富盍Χㄒ澹焊貌舛ㄌ跫糠种幼;璧拿噶慷ㄒ逦R桓雒富盍Φノ弧高聚合度异麦芽寡糖的制备以溶于/宜嵋灰宜崮苹撼逡旱疞麦芽糊精为底物,加入一定量的一葡萄糖苷酶酶液及酶液,在一定温度下于转速为痳∫〈中反应一定时间,反应完成后煮沸灭酶。:以甤痬下的苷,篐。琄。珻·琈·琋。,,,以,:万方数据系调整为,加入痝缘孜镏柿考高温仅一淀粉酶、痝淀粉葡萄糖苷酶缘孜镏柿计痝缘孜镏柿考普鲁兰酶消化处理未反应完全的麦芽糊精,于℃、痬水浴摇床中反应笾蠓忻鹈福胄牡玫讲颕”。高聚合度异麦芽寡糖的制备工艺优化时问优化反应条件为,底物为值在~的疞麦芽糊精,一葡萄糖苷酶加酶量控制为痝缘孜镏柿考,每隔取样,至从崾温度优化控制其他条件不变,将反应温度分别设置为、、、、℃,反应时问为优化控制其他条件不变,将反应分别设置为、、、、,反应时间为底物种类优化控制其他条件不变,将底物种类分别设置为值为滴~、值为~的麦芽糊精,反应时间为加酶量优化控制其他条件不变,将黄咸糖苷酶加酶量分别设置为、、、痝缘物质量计从κ奔湮复配酶加酶量优化控制其他条件不变,黄咸烟擒彰讣用噶课痝缘孜镏柿考,将复配酶酶量分别设置为、、、缘孜镏柿考,每隔⊙酶转化产物的检测将酶转化产物进行一定比例的稀释后使用四す耍票傅玫液相检测样品,使用检测相关产物的含量,计算得率,其中鞍珼的高聚合度组分和异麦芽糖。测定高聚合度成分使用的程序及参数:液相色谱系统,差检测器,—字温℃,检测器温度为,以纯水作为流动相,流量为/ü婊橐环ǘ圆锒俊2定异麦芽糖使用的程序及参数:液相色谱系统,静罴觳馄鳎¨色谱柱,柱温及检测器温度为℃,以体积分数为%的乙***为流动相,流量为/ü獗攴ǘ圆物定量。酶转化产物的分离将得到的酶转化产物离心后,加入痝缘孜镏柿考的活性干酵母消化去除葡萄糖,于痬摇床下反应笾蠓忻鹁胄姆掷牒蟮玫缴锨逡骸=锨液冷冻干燥,得到产品,即为粉末。相对分子质量测定使用高效凝胶排阻色谱法舛↖“产物的平均相对分子质量,貌镌诹鞫嘀械奶寤笮⒘鞫速度对其进行大小测定。柚贸绦蚣安问柱,柱温为℃,以,为流动相,流量为链长分布使用高效阴离子交换色谱—对产物成分进行分析。狿利用微孔聚合阴离子交换树脂对≤的糖组分进行交换层析,随后进入检测器进行分析。采用一胱由滓墙屑觳猓褂字乙酸钠为流动相,流量为】./褂寐笱亢作为标准品。核磁光谱分析狽迫冷冻干燥后的产物,溶于重水中,其中重水中含有用于校准化学位移的内标物疞三***硅烷磷酸酯。使用全数字化核磁共振波谱仪诨肪澄露认乱圆方氢谱分析。。.Φ牢⑸锏呐嘌ň暧婧阄潞湿厌氧培养箱中静置培养~谢罨T诨化扩大培养后,取一定量的菌液分别转接至含有啊⑹惺跧、未添加其他碳源瞻的基础培养基中,使得初始..于℃恒温恒湿厌氧培养箱中静置培养。分别在⊙舛ň涸处吸光度及发酵液变化,分别绘制对应曲线,比较不同碳源下不同肠道微生物的生长状态高聚合度异麦芽寡糖产物制备酶转化单因素优化为了提高浚酶转化涉及参数进行了优化。首先采用单因素实验分析了反应时问、、温度、底物种类、加酶量对爸票傅挠跋见图。,以,反食品畚锛级П甑淼期、痝、疞/疞万方数据谆蒋应为,底物选择葡萄糖含量较高的值为~的麦芽糊精,黄咸烟擒彰讣用噶课缘孜镏柿考,在此最优条件下寐首罡呖达.%。基于单因素研究结果,复配使用,探究了复配酶加酶量及反应时问对得率的影响。产物得率在不同复配酶加酶量下随时问的变化结果如图尽T诟磁涿讣用噶课缘孜镏柿考,反应时间为保寐蚀锏浇为稳定的水平,暗寐首罡呖纱ィ渲腥糖及以上高聚合度组分占比可达.%。,对生成产物进行水解,从而降低制备效率。双酶复配优化图耙黄咸烟擒彰钢票窱优化结果痝.《反应时间/反应时间的优化温度/露鹊挠呕瞳挠呕值为瘴~瘴麦芽糊精孜镏掷嗟挠呕加酶量//用噶康挠呕Ⅱ一,:摹更万方数据避。愚葛苦。鰀豳譬。震装糖酶堑萩弧糖苷酶键蔷:■■■■叫—一凸辭%行校正,捌骄喽苑肿又柿俊胛,这说明5骭臁。—≥巍对转化产物消化前葡萄糖含量和消化后高聚合度组分含量进行分析,如表荆笛榻峁明,在复配后,产物的葡萄糖组分明显减少,暗寐实玫酱蠓忍嵘っ魉父磁浞ㄔ一定程度卜利用了葡萄糖并生成了更长链的糖分子。根据黄咸烟擒彰负虲饔没疲髡绘制如图乃父磁湓硎疽馔肌黄咸烟擒彰主要以底物中麦芽糖、麦芽三糖为主的寡糖为供体底物,通过第一步反应生成葡萄糖一“一葡萄糖苷酶复合物,第二步以水分子或葡萄糖、、潘糖等煞帧一葡萄糖苷酶的水解活性较高,因此体系中会存在大量葡萄糖,在转苷反应中该葡萄糖同时也会与生成的异麦芽糖、潘糖等竞争,不利于三糖及以上聚合度寡糖生成。在复配使片后,、麦芽糖等小分子糖为受体发生转苷反应¨锰逑挡钠咸烟牵煌时,也会将麦芽多糖转化成聚合度降低的麦芽寡糖,为“一葡萄糖苷酶提供转苷反应底物。这些可能是复配能够提高产物聚合度和得率的产物结构分析慕峁褂胄灾嗜【鲇诰酆隙取⑻擒占比例、葡萄糖单元连接方式等,其中聚合度越高,一糖苷键比例越高,产物结构越复杂,讲灰在消化道中被消化,益生效果更好。为确定产物结构与性质,对平均相对分子质量、链长分布及键型比例进行测定。如图所示,对产物相对分子质量进行测定,,使用高效阴离子交换色谱对链长分布进行了分析,结果如图所示,相较于市售琁“高聚合度组分占比更高。为进一步鉴定产物键型,使用—,擒占汀耙糖苷键的特征峰,按照峰面积比例计算,产物“一糖苷键达到.%,相较于市售键型占比,案加攀啤8莶舛ń果,。肠道益生菌如双歧杆菌可选择性利用含有“,。作者将及市售魑L荚刺加到基础培养基中,以基础培养基瞻为对照,选取***肠道益生菌双歧杆菌中占比最高的两种鲁品畚锛级甑淼期原因。.で弑浠图父磁溆呕峁表白榉单酶制备双酶复配廿!!÷图父磁湓硎疽馔廷时间,—.一一?一。。。。。。?一一一一一万方数据蚍。一。/菌种——青春双歧杆菌及长双歧杆菌和肠道条件致病菌大肠杆菌作为研究对象,考察了对益生菌、条件致病菌生长状况的影响。图及图直鹞G啻核绺司俺に绺司纳で线,岸砸嫔啻核绺司哂性鲋匙饔茫对长双歧杆菌作用效果与嘟和肠道条件致病菌大肠杆菌的生长曲线,岸猿Φ条件致病菌大肠杆菌具有抑制作用,具有一定的体外益生功能四。肠道益生菌在生长过程中会代谢如乙酸、丁酸等短链脂肪酸,这些化合物会降低肠道环境,抑制肠道有害菌的生长,同时减少有害代谢物质的生成。通过变化情况,可推断肠道微生物生长环境的变化及有益代谢物质的生成。如图及图所示,与空白组相比,青春双歧杆菌及长双歧杆菌在含盎∨嘌信嘌辈生酸性物质降低环境,其变化与浠图镄灾什舛ń峁寸啻核绺司で榭图Φ牢⑸§时间/に绺艘衽t耷兄时/Φ捞跫虏【蟪Ω司で榭,:毋鼍星一万方数据揄嘞嵊参考文献:的接近;图为肠道条件致病菌大肠杆菌的生长变化相较于械母曲线。大肠杆菌在含基础培养基中培养时作者基于一葡萄糖苷酶生产纳艺,复配使用了,研究了的制备工艺、产物结构及体外益生功能。结果显示,.%,其中三糖及以上高聚合度组分占比达到.%。经过消化、冷冻干燥后的产物平均相对分子质量为琌糖苷键键型占比达到.%,对益生菌青春双歧杆菌具有增殖效果,且对于肠道条件致病菌大肠杆菌具有抑制效果。相较于市售哂更良好的产品性质及体外益生功能。研究结果为墓ひ抵票柑峁┝诵滤悸贰T诤笮芯恐校对黄咸烟擒彰附薪峁狗治霾⒏脑欤岣咂渥\,—许滢,等:高聚合度异麦芽寡糖的制备及体外益生功能评价图Φ牢⑸锾逋馀嘌鴓浠榭瓹:.时间,啻核绺司鷓浠榭时间/Φ捞跫虏∫翊蟪Ω司鷓浠榭珼珺琫—,—,:,.—:,,:.勰况隋比变歧双氏∽△甇—工盆眨万方数据—:—.,,—鬃恿幔饩矗玛桑龋谟倚囚铣捎虢到獾牧讲椒ㄖ票傅途垡炻笱刻荹食品与发酵工业,,:.—.籇—一橐籇—.,珺,,—琖.,,:.甁,,—”:江南大学,.琖—瓼黄婧,,,:—.琄瓸珺珽甌.】琒猇琈:—.甅瓸珺,,琘...琇.:.琖琫琇—,—琈瓹,,瓹珹甀..觑:.珻瓵.,—琾—琄.:琍甋琀—/—猳/一猤狶—琑甋珿琑,,:痶猻

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  • 时间2024-03-27