二甲双胍对高糖环境下的大鼠胎盘病理变化影响的机制研究.pdf

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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。:..·890·生殖医学杂志2023年6月第32卷第6期DOI:.1004—·二甲双胍对高糖环境下的大鼠胎盘病理变化影响的机制研究孟睿1’2,魏莹1’2,关丽娜1,苏冬梅1’2。(,北京100081;,北京100730)【摘要】目的探究二甲双胍对高糖环境下的大鼠胎盘病理变化影响。方法将12只造模成功的妊娠期糖尿病雌性大鼠随机分为糖尿病组(竹一6)和二甲双胍组(n=6)。二甲双胍组采用二甲双胍灌胃给药,剂量为300mg/kg/d,每3d称重调整药物剂量;糖尿病组给予等体积的饮用水,,处死取材;观察分析胎盘组织HE染色的结果;通过RNA_Seq测序筛选出差异表达基因,并对差异基因进行G0和KEGG富集分析。结果二甲双胍组大鼠血糖显著低于糖尿病组,二甲双胍组的孕鼠体重、胎盘重、胎盘系数及活胎数均显著高于糖尿病组(P<);糖尿病组胎盘纵切面面积显著变大、胎盘各层厚度显著增加(P<)。转录组测序共筛选出318个差异表达基因,与糖尿病组相比,二甲双胍组上调基因142个、下调基因176个;选取5个基因进行实时定量PCR验证,检测结果与RNA测序结果一致。G0分析显示差异表达基因主要富集在生物进程、细胞组分、分子功能等;KEGG富集结果提示TGF一8信号通路、Hippo信号通路、Relaxin信号通路等差异基因数量较多;通过G0和KEGG联合分析,筛选出殆馏、No￡c加、胁￡】j、F6月】、Co舡口2为二甲双胍治疗的新的效应基因。结论二甲双胍的干预治疗可有效缓解妊娠期糖尿病大鼠胎盘的病理改变;转录组测序提示许多基因存在差异性表达,但其具体机制亟待进一步探究。【关键词】妊娠期糖尿病;胎盘;二甲双胍【中图分类号】【文献标识码】AMechanismstudyoneffectofmetforminonpathologicalchangesofratplacentainhighglucoseenVironment』坦ENGR“i1~,WEIⅥ咒91“,GU-ANLi一咒口1,SUDo咒g—m8i1·2’。厂Ge咒efic5,N盘￡io行口ZR8sg口rc九j咒s￡i￡乱￡g/'0rF口miZyPZn咒咒i咒g,“n￡PSc矗ooZ,P8愚i729Unio行A如dic&ZCoZZPgP,B8i歹ing100730【Abstract】ObjectiVe::essfullyinducedgestationaldiabetes,andthenrandomlydividedintodiabetesgroup(竹一6)andmetformingroup(咒一6).Theratsinmetformingroupwasadministratedintragastricwith300mg/kg/daymetf。rmin,‘“—Seqsequencing,:Thebodyweight,placentalweight,placentalcoefficientandnumberoflivebirthsinparedwiththediabetesgroup(P<).The【收稿日期】2023一01—14;【修回日期】2023一03—17【基金项目】国家自然科学基金项目(31871391)【作者简介】孟睿,女,辽宁沈阳人,硕士在读,细胞生物学专业.(。通讯作者,Email:sudongmeisdm@)万方数据:..生殖医学杂志2023年6月第32卷第6期·891·longitudinalsectionareaofplacentaandthethicknessofplacentalayersweresignificantlyincreasedinthegestationaldiabetesgroup(P<:).Atotalof318differentiallyexpressedgeneswerescreenedbytranscriptomesequencing(P<).Comparedwiththediabetesgroup,therewere142up—regulatedgenesand176down——,ceIIularcomponents,-psignalpathways,Hipposignalingpathways,Relaxinsignalingpathways,,Tg/仞,No￡c加,Wk￡】】,:,:Gestationaldiabetes;Placenta;Metformin(JRep加dM以2023,32(06):890—897)妊娠期糖尿病是在妊娠期间以血糖升高为主要(SD)大鼠16只、雄性SD大鼠10只购白北京维通表现的代谢异常性疾病[1]。胎盘是一种高度专业化利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:SYXK的临时性器官,调节着母体和胎儿之间的许多代谢(京)2018一0010。将购置动物置于国家卫生健康委活动。既往研究表明,妊娠期糖尿病的大鼠胎盘重科学技术研究所实验动物中心饲养,动物中心维持量会显著增加[2]。当妊娠期糖尿病发生时,胎盘处温度在(23±1)℃,空气相对湿度在(60±10)%,于低水平炎症状态[3]。深入了解妊娠期糖尿病所导12h昼/夜循环照明,保证大鼠食水充足。:高脂高糖饲料(北京科奥况的发生,适当的药物干预有助于改善病理现象的协力);血糖仪(罗氏,德国);链脲佐菌素(Sigma,美发生和预后。二甲双胍作为一种低成本、有效、经典国);柠檬酸钠缓冲液(北京索莱宝);盐酸二甲双胍的糖尿病治疗药物,(默克,德国);RNA提取试剂盒(南京究日渐增多。多项研究证实,妊娠期糖尿病孕妇使诺唯赞);ABScriptⅢRTMasterMixforqPCR用二甲双胍后,孕妇血糖情况以及妊娠结局与单用withgDNARemover、2XUniversalSYBRGreen胰岛素相似,同时孕期增重情况减少,较胰岛素更具FastqPCRMix(武汉爱博泰克);Stepone实时定量优势[4‘6]。国内亦有大量研究表明,在孕早期及孕前PCR仪(Thermo,美国)。应用二甲双胍,不但不会增加胎儿的畸形率,还能够二、研究方法一定程度上提高受孕率[7-9]。:将购置的SD大鼠进环境下的胎盘病理变化影响的机制尚不明确。行适应性喂养一周后,禁食12h,测定空腹血糖,排本研究拟通过构建妊娠期糖尿病的大鼠模型,对除空腹血糖≥。给予血糖妊娠期糖尿病大鼠进行二甲双胍干预,观察二甲双胍正常大鼠高脂高糖饮食,喂养5周。5周后,将产生对妊娠期糖尿病大鼠的胎盘异常改变的治疗效果,并胰岛素抵抗大鼠以雌雄比例1:1于每天17:30~结合RNA测序(RNA-seq),在全基因组范围内探索18:30合笼交配,第二天7:30~8:30发现阴栓者记复杂疾病的分子机制,。禁食不禁水7h后,造模大鼠均关的新基因和信号通路,以期发现新的治疗靶点。一次性腹腔注射1%的链脲佐菌素(STZ)溶液(,28mg/kg),注射材料与方法sTZ72h()后,孕鼠尾静脉取血,筛选随一、实验材料机血糖≥14mmol/L者即为妊娠期糖尿病大鼠。:SPF级4周龄雌性Sprague-Dawley共有12只大鼠造模成功。将妊娠期糖尿病大鼠分万方数据:..生殖医学杂志2023年6月第32卷第6期为糖尿病组(咒=6)和二甲双胍组(咒=6)。从妊娠重量相差较大的胎盘样本,每组3个,,二甲双胍组采用二甲双行RNA提取。根据制造商的说明书,构建文库,然胍灌胃给药,参考孕妇给药剂量进行等效换算,选取后在测序平台上对文库进行测序。对基因的表达水更接近既往研究文献[1叫1]的给药剂量300mg/k∥d,平以及转录本的表达水平分别进行定量分析,使用每3d称重调整剂量;糖尿病组给予等体积的饮用软件DESeq2对多样本(>2)项目进行样本/组间基水,。,给予大鼠因的表达差异分析,进而研究差异表达基因的功能。***,取出胎盘样本。显著差异表达基因的默认筛选标准为:FDR<:,<>&l092FC≥1,差异死,称体重,分离出胎盘,去掉多余组织,于生理盐水表达基因(DEG)需同时满足上述两个条件。中冲洗干净并吸去多余水分。电子天平称重胎盘,:利用RNA提取试剂盒得出胎盘系数[胎盘系数(%)=胎盘湿重(mg)/体从各组组织中提取总I州A,通过逆转录合成cDNA。重(g)×100%]。将胎盘一分为二,一半置于4%甲在StepOne实时定量PCR仪上进行检测,引物序醛溶液中固定,另一半置于液氮罐保存。列详见表1。使用pActin作为内参。:将4%甲醛溶液下:预变性95℃3min,95℃变性5s,60℃退火、扩中固定好的大鼠胎盘进行石蜡包埋,并对结构完整增34s,45个循环反应。测定大鼠胎盘中Mm矽、样品进行切片烘干,保存备用。胎盘组织的石蜡切Tg舶2、T2ni乡、No￡c加、SZc026j的表达水平。所有片经二甲苯脱蜡,再乙醇脱水后,放人苏木素液中染样本重复3遍。使用2一蛳‘法进行定量计算,其中色3min,再通过伊红液染色1min;最后中性树胶△△Ct为校准Ct值。基于文献,分析验证转录组测封片,于光镜下观察。序的实验数据。通过对结果的分析,—Seq测序:选取两组间序数据的准确性。:使用Gbatools对本次数±标准差(互±s)表示,组间比较采用￡检验。P<结果进行富集分析,。验。当校正P值(pfdr)≤,可以认定GO功能结果存在显著富集情况。使用KOBAS对本次结果进行KEGGPATHWAY富集分析,计算原理及检验方一、两组大鼠妊娠结局及胎盘状态比较式与GO功能富集分析相同。校正P值(:P-Value),符合要求的KEGG通路可二甲双胍组大鼠毛发、体形及精神状态明显优于以认定在差异表达基因中显著富集。糖尿病组。二甲双胍组大鼠血糖显著低于糖尿病三、统计学分析组(图1)。二甲双胍组的孕鼠体重、胎盘重、(P<析,PhotoshopCS8软件进行作图。)(表2)。万方数据:..生殖医学杂志2023年6月第32卷第6期·893·:,在光镜下可见大鼠的胎盘组织分为3层:蜕膜层(D)、连接层(J)和迷路(I。)。与二甲双胍组相比,糖尿病组大鼠的胎盘组织分层界限不明显,胎盘纵切面面积显著变大,胎盘厚度显著增加(图2)。两组蜕膜层、连接层、迷路层的厚度存在显著差异(P<)(表3)。表2二甲双胍对糖尿病大鼠胎盘及妊娠结局的影响(i±s)注:与糖尿病组比较,’P<。AA:糖尿病组大鼠胎盘纵切面(×15);B:糖尿病组大鼠胎盘纵切面各层分布情况(×40);C:二甲双胍组大鼠胎盘纵切面(×15);D:二甲双胍组大鼠胎盘纵切面各层分布情况(×40)。注:L,迷路层;J,连接层;D,蜕膜层。图2两组大鼠胎盘的形态学观察(HE染色)表3二甲双胍对糖尿病大鼠及妊娠结局的影响(F±s)RNA—Seq结果提示,糖尿病组与二甲双胍组之间共鉴定出318个DEGs,与糖尿病组相比,表达上调基因142个、下调基因176个(图3)。从中选择Mm矽、、了■行ip、Nofc加、SZc026】五个基因进行实时定量PCR的验证,DEGs的mRNA表达水平与RNA测序结果一致;与糖尿病组相比较,二注:与糖尿病组比较,’P<,”P<。甲双胍组Mm矽、、h行ip的mRNA表达下二、两组大鼠胎盘的基因表达情况调,No￡f加和Szf026j的mRNA表达上调(图4)。万方数据:..生殖医学杂志2023年6月第32卷第6期一l一0誓:!虿皇样本2样本3川I“呱川精版慨川图3两组大鼠胎盘组织差异基因分组聚类图5等)进行分析研究(图5B)。结合GO和KEGG的分析结果做进一步的数据检索,最终我们初步筛选4Tg厂62、No￡f加、W押￡jj、F6九J、Co以n2等基因为二甲双胍治疗的新的效应基因,为后续深入研究提供3前期的理论依据。2浏蝈搽莨靶《z∥IIII讨论1妊娠期糖尿病是一种复杂的代谢性疾病,其病O理机制涉及多种蛋白质、酶和激素的变化。既往研究发现,并非所有降糖药联合胰岛素的治疗方式,都图4可以改善妊娠期糖尿病的胎盘状态[12。。故而我们两组胎盘中Mm矽、T膏,磁、丁0”i户、No￡f削、Sff(|26j的mRNA相对表达量认为除葡萄糖水平外,还可能有其他因素参与妊娠期糖尿病胎盘改变的病理生理过程。二甲双胍作为三、大鼠胎盘组织差异表达基因的G0分析和一种低成本、有效、经典的糖尿病治疗药物,除了能KEGG分析调节血糖、有效延缓并治疗二型糖尿病外,还能通过G()分析结果提示,差异表达基因主要富集在抗炎、协助能量代谢等未知的方式为患者提供显著生物进程(例如丁g馏、No￡f觚、亿以i户、F6川等)、的保护效果,进而发挥多种临床作用口”“]。对二甲细胞组分(No￡f^j、n以ip、w行￡jj等)、分子功能(包双胍作用机制的深入研究,有可能为妊娠期糖尿病括Mm矽、Tg/-62、No￡f加、SZc026j、T■,2ip等)等患者和胎儿保护和治疗提供更多的选择[8]。本研究(图5A)。从KEGG富集结果中,我们挑选了较为比较了糖尿病组大鼠和二甲双胍组大鼠在妊娠第感兴趣的TGF—B信号通路(包括T奢拍2、F6挖j、,发现二甲双胍组大鼠胎盘各B优雄等)、Hippo信号通路(包括Tg胆、Bm雄、层厚度均有显著变化,这可能与胎盘差异基因的表W竹￡Jj等)、Relaxin信号通路(包括Mm矽、Co以n2达、激素分泌、细胞的异常增殖等有关。万方数据:..生殖医学杂志2023年6月第32卷第6期·895·AmolecularmncfionreproductiVeprOcessmulticellularo唱anismaIprocessponento唱anizaCionorbiogenesislocalizationmeCabolicprocessresponseCostimulusdcVelopmentalpmcessbiologicalregulationcellularpmcessprotein-plexextracellularregionpano唱anellepanmembraneO唱anellemembranepancellpantransporter磊丽m01ecularfunctionregulatorcacalyticactiVitybinding020406080100120140160180200220NumberofgenesBCyh岛h岛上≥矗厶矗厶o0山0山2NLllllber●Z●n●9r1viralproleininteractionL一4RichI?ncl‘)r.\:(;()j一:f班分忻憾小㈥:I{:KH,(;钳氍j,惭7L泡H图5两组间差异表达基因的生物学功能及分子信号通路的富集情况、通过转录组测序,发现318个基因表达差异显致胎盘滋养层扩散;在Yu等‘173的研究中,妊娠期糖著,基于文献,我们从中选取了5个DEGs进行实时尿病患者胎盘中cAMP—PKA信号传导的激活,同定量PCR验证。Sdnchez-Santos等‘161的研究表明,样也会伴随着MMP9转录本和活性的增加,从而促高血糖可诱发氧化应激、纤溶酶原激活物抑制剂1进细胞侵袭。SZf026j作为炎症相关基因,在胎盘(PAI一1)和基质金属蛋白酶9(MMP9)表达增加,导发生炎症反应时,该基因表达降低m]。Sarina等‘191万方数据:..生殖医学杂志2023年6月第32卷第6期的研究表明,妊娠期糖尿病患者的胎盘中TXNIP化缺陷[26|。在本实验中,Co以口2mRNA在糖尿病的含量显著高于对照组,细胞凋亡数增加,其对胎盘组表达低于二甲双胍组;二甲双胍可能与Relaxin的损伤程度有待进一步的探索。以上报道结果显信号通路中的COLLA2密切相关。上述基因与胎示,MMP9、SLC0281和TXNIP表达变化与胎盘盘发育进程、增殖迁移及病理改变密切相关,有可能异常密切相关。本研究结果显示,二甲双胍给药后是二甲双胍改善胎盘病理变化的潜在效应基因,后可以显著降低№p9mRNA和Tz行i声mRNA的续我们将进一步进行差异表达验证和深入研究。表达,提高S2c026jmRNA的表达,该结果与之前综上所述,对于妊娠期糖尿病,二甲双胍的干预报道较为一致,提示MMP9、SLC0281及TXNIP治疗可有效缓解妊娠期糖尿病大鼠胎盘的病理改很有可能是高糖引起胎盘异常的治疗靶点。对于变,更有利于维持大鼠的血糖水平及体重增长,。同时我们还发现二甲双胍干预后前较少。Zhou等[20]的研究表明,TGFBl和的妊娠期糖尿病大鼠的胎盘中有许多基因的表达发TGFB2在妊娠期糖尿病患者胎盘和血浆中显著上生了显著变化,其具体调节机制还有待进一步探索。调,故认为血浆中的TGFBl和TGFB2可作为妊娠【参考文献】期糖尿病有效诊断的标志物。我们从GO和KEGG的结果中可以看到,[1]TangY,Gu。J,LongQ,。stpartum息相关;实验结果也显示,estati。nalmunity[J].JAdvNurs,2020,mRNA表达显著降低,提示其作为治疗靶点的潜10:。NOTCHl在高血糖诱导的氧化应激引起的妊[2]庄瑕怡,应豪,(CHDs)大鼠模型的研究[J].现代妇产科进展,2014,23:607—[z¨。暴露于母亲的妊[3],对研究[D].西安:陕西省西安医学院,2021.[4]s。ciety。fmaternal一fetalmedicine(sMFM)publications胎儿肾脏进行检测,:Pharmacologicaltreatmentof少[22|。最新报道,NOTCHl可以缓解妊娠期糖尿gestati。naldiabetes[J/0L].AmJ0bstetGynecol,2018病胎盘的滋养层细胞损伤[23|。结合我们GO和218:,NOTCHl在内分泌及细[5]FeigDs,D。novanLE,zinmanB,,我们后续withtype2diabetesinpregnancy(MiTy):amulticentre,将进行深入研究。international,randomised,placebo-controlledt“al[J].LancetDiabetesEndocrinol,2020,8:834—,还发[6]LandisN,Radkes,EngeIsM,etaI'Association。fIong—term现一些与胎盘异常相关的新基因。其中FBNl作为childandoutc。meswithmetfominvsgrowthdeveIopmentaI一种基质糖蛋白,参与弹性纤维的形成,estationaldiabeLes口].JAMAPediatr,宫内膜以进行胚胎植入中起作用[2州。本研究结果2019,173:,糖尿病组的F6以mRNA表达显著低于二甲[7]詹凌圣,,初步推测二甲双胍通过TGF—B信号通路,糖尿病的疗效及对妊娠结局和新生儿的影响[J].医学理论与实践,2019,32:1732—。[8],糖尿病组中的1阢￡】jmRNA对母儿的影响[J].中国实用乡村医生杂志,2021,28:59—。据文献报道,通过下调[9]王文丽,,可以显著减少先兆子痫胎[J].中国妇产科临床杂志,202l,22:665—[25|。根据KEGG结果[10]s。ngAQ,SunLR,zhaoYX,,二甲双胍可能通过Hippo信号通路,以metfominonmethylationandgIycolipidmetab01ismofperoxisomeproliferator_activatedrecept。r7c。activator_1AofWNTll为靶点影响胎盘滋养层细胞的增殖和迁移ratoffspringwithgestationaldiabetesmellitus[J].AsianPac情况。子宫内膜异位症的内膜中组蛋白去乙酰化酶JTropMed,2016,9:91—(HDAC3)蛋白含量减少,COLLA2作为小鼠和人厂11]ForcatoS,NoviDRBDS,CostaN0,,异常转录激活会引起蜕膜lactationalexposuretometformininducesreproductive万方数据:..生殖医学杂志2023年6月第32卷第6期·897·aIterationsinmaleratoffspring[J].ReprodToxicol,2017,patientsamplesandgenefunctionalresearchincellline[J].74:48-,2019,10:2265—2288.[12]sobreviaL,salsosoR,FuenzalidaB,[20]zhouH,chenP,DaiF,-regulationofTGFBIandmodulatoroffetoplacentalendotheliummetab01icTGFB2intheplasmaofgestationaldiabetesmellituspatientsdisturbancesingestationaldiabetesmeIlitus[J/OL].Frontanditsclinicalsignificance[J].IrJMedSci,2022,19l:Physiol,2016,7:—2033.[13]DziubakA,w6jcickaG,wojtakA,[21]CerqueiraDM,HemkerSL,BodnarAJ,[J].IntJMolSci,2018,exposuretomaternaldiabetesjmpairsnephronprogenitor19:[J].AmJPhysiolRenaIPhysiol,2019,317:[14]LisN,wangx,zengQT,-sensitivity[22]ShimanukiY,MitomiH,FukumuraY,-reactiveproteinleveIinexpe“mentalatherogenesisofdelta—likeligand1andNotch1receptorinvariousplacentalrabbits[J].HeartVessels,2009,24:446—[15]ChenQ,ThompsonJ,HuY,].HumPathol,2015,46:11