镁离子螯合酶D亚基互作蛋白P43功能研究.pdf

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叫。~i17一·‘∞o∞?ci%0—jk磊堡F..‘i’·。/一’‘j%^≮!!:-:!!≯帮‘赫,描‰y..‘i’·。/一’‘j%^≮!!:-:!!≯帮‘赫,描‰y睇《f了’...”、j:|v^。,/“<D奄厂c溉’h器o’。复“’夏￥0’二一.::篙燎已,秽a啊帕——-·一戗粤一~≯L√.,,,≤美茏激。I唯一.‘≥、,一.,≥m蚍。,:-扣I即一,.一P叩H矿‘’。飞'1、,a,鼬qt_it‘l^’,臼忡~¨、^,L∥一图2叶绿素生物合成的镁分支途径(Masuda2008)Fig2·Mgbranchofthetetrapyrrolebiosynthesistoleadingchlorophylls4:..,是由I、D、H三个亚基组成的异源聚合酶。镁离子螯合酶的克隆最早始于对两种光合红细菌Rhodobactersphaeroides和Rhodobactercapsulatus突变体的研究(Coomberetal1990;Bollivaretal1994),研究初步认定编码细菌叶绿素合成的主要基因集中位于染色体上一段45kb的片段上,这一片段被称为光合作用基因簇(luster)。1995年Gilberson等将Rhodobactersphaeroides中bchlD、bchU和bchlH在大肠杆菌中进行表达,并在体外进行了酶活重组实验,实验发现在ATP存在的条件下,体系中同时加入bchlD、bchH和bchlH能够使得镁离子螯合到原卟啉Ix中(al1995)。随后Peterson和Willows等通过体外表达Chlorobiumvibrioforme和Rhodobactercapsulatus的bchlD、bchⅡ和bchlH,对镁离子螯合酶的重组测活进行了探讨(al1998;WillowsandBeale1998)。真核生物中镁离子螯合酶6803中进行,Jensen等通过同源6803中镁离子螯合酶chli、chld和chlh的序列,并通过大肠杆菌进行体外表达纯化得到目的蛋白,通过ATP依赖的体外重组测活实验证明了只有当CHLI、CHLD和CHLH三个亚基同时存在时,才能发挥镁离子螯合酶活性将M92+螯合到卟啉环中(al1996a)。同时Jensen等通过黄化突变体的分析克隆得到了大麦中编码镁离子螯合酶的基因Xantha-f,Xantha—);通过对豌豆cDNA文库的筛选,Nakayama等克隆了豌豆中chli基因(Nakayamaetal1995),Luo等得到了豌豆chld的序YlJ(Luoetal1999);Kruse等通过文库的筛选克隆得到了烟草中编码I、H亚基的序ylJ(Kruseetal1997);Papenbrock等通过同源克隆得到了烟草chld的序列,并利用酵母双杂交系统研究了镁离子螯合酶各亚基之间的相互作用(Papenbrocketal1997)。随后玉米、拟南芥、水稻、豌豆等高等植物中编码镁离子螯合酶I、D、H三亚基的基因陆续被克隆(Nakayamaetal1998;Mochizukietal2001;Jungetal2003;Sawersetal2006:al2013),为之后高等植物中镁离子螯合酶的研究奠定了基础。:..华中农业大学2013届硕士研究生学位(毕业)论文在众多的编码镁离子螯合酶的基因中,编码拟南芥镁离子螯合酶I亚基的基因有两个,为chlil、chli2(Rissleretal2002),通过突变体的分析发现,野生型拟南芥叶绿体中CHLl2的表达量低于CHLll,I亚基主要由chlil基因编码,但在去白化的过程中,需要CHLll、CHLl2的共同参与,在完全缺失CHLll时,CHLl2能够替代CHLll的功能,完成叶绿素的合成(HuangandLi2009)。在大麦、拟南芥、豌豆等植物中,镁离子螯合酶chli(chlil和chli2)、chld、chlh基因的表达都受到光照的诱导,在去白化的过程中其表达含量都明显上升。其中在大麦和大豆中,CHLH被证明其表达具有昼夜节律性,且在光照情况下表达量达到最高(al1996b;Nakayamaetal1998);在拟南芥、大麦和大豆中,CHLI为组成型表达(Nakayamaetal1995;al1996;al1996b)。在烟草中,CHLI与CHLH表达模式相似,而CHLD却呈现不同的表达规律,并且在黑暗时其表达量达到最高(al1999)。,Walker等首次将镁离子螯合酶的催化过程分为了两个步骤——镁离子螯合酶的激活和镁离子的螯合(WalkerandWeinstein1994)。Willows等人随后利用光合细菌进行了镁离子螯合酶的重组测活,研究发现激活步骤中需要Mg“、ATP、I亚基和D亚基的参与,具体反应过程为:一方面在同时存在M92+和ATP的条件下,I亚基与D亚基分别以六聚体的形式形成环状结构,随后两个六聚体环聚合形成Mg—;另一方面,H亚基与原卟啉IX、M92+同时结合,形成Mg—H—protoporphyrinIX复合物。激活步骤中虽然有ATP的参与,但此过程中并不水解ATP提供能量,也可用ADP以及ATP类似物如5’.[]triphosphate(ATPTS)代替ATP,这是因为D亚基的I结合域与I亚基的I结合域相结合,从而导致I亚基的ATP酶活性遭到了抑带lJ(al1999;Fodjeetal2001:Lakeetal2004)。6:..(Masuda2008)ycleofMg—,首先H亚基的I结合域与D亚基的I结合域相互作用,水解ATP。,形成Mg—protoporphyrinIX。该反应过程中需要ATP的水解供能驱动反应的进行,使得H亚基与原卟啉Ix形成复合物将镁离子插入到卟啉环中(al1999)。高等植物中镁离子螯合酶的I亚基和D亚基的N端序列具有高度的同源性,都属于AAA+(ATPaseassociatedwithdiversecellularactivities)蛋白家族(Neuwaldetal1999),其中I亚基具有ATPase活性(al1999;al1999),而7:..华中农业人学2013届硕士研究牛学位(毕业)论文D亚基没有(HanssonandKannangara1997)。Fodje等认为D亚基的序列中中间一段连接N端和C端结构域,富含脯氨酸的区域可能参与I、D亚基的结合(Fodjeetal2001)。继而在烟草中被指出,这段参与I、D亚基的结合并维持镁离子螯合酶活性的区段为横跨连接结构域(1inkerdomains)的110aa残基的特定序@(Grafeetal1999)。同时D亚基的C端存在整合I亚基的结构域,有利于D亚基与I亚基、H亚基的结合(Fodjeetal2001o体外实验证明I亚基的ATPase活性有利于D亚基的复性,且其在植物体内对维持D亚基的稳定具有重要的意义(Lakeetal2004;Luoetal20131。P·pro&negativelychargedregionAAA·likedomain聂弓葛芦1...一ntegrinIdomainBchDBchI图4红细菌中D亚基与I亚基的结构(Lundqvistetal2010),H亚基被认为是镁离子螯合酶中的催化亚基(ReidandHunter2002),且H亚基能够结合卟啉(Willowsetal1996;WillowsandBeale1998)。虽然H亚基与I、D亚基不同,不属于AAA+蛋白fATPaseassociatedwithvariouscellularactivities)家族,但在红细菌、绿硫细菌和蓝细菌中,H亚基被陆续报道其具有ATPase活。N!(HanssonandKannangara1997;al1998;al1999;al1999),但2006年Sirijovski等人对这一观点产生了质疑,利用凝胶过滤层析他们发现在大肠杆菌中表达H亚基时,会同时产生一R:..镁离了螯合酶D亚基可=作蛋白P43功能研究种小分子量的蛋白,该蛋白具有ATPase活性,而纯化出的大分子量H亚基不具有,所以光合作用生物中的H亚基自身并不具有ATPase活性(Sirijovskietal2006)。除了镁离子螯合酶I、D、H亚基外,还存在另一个参与镁离子螯合酶活性的蛋白GUN4。Susek等通过筛选突变体文库,找到了5个具有解偶联(genomeuncoupled,gz,门)表型的拟南芥突变体,其中一个就是gun4(Suseketal1993)。GUN4主要存在于高等植物和藻类中,部分光合细菌中也存在类似蛋白,GUN4除了参与叶绿体和细胞核的信号传导外,还能通过结合镁离子螯合酶底物原卟啉和镁原卟啉参与调节镁离子螫合酶活一陛(al2003)。Davison等通过对GUN4的晶体结构进行分析,发现了一个类似手掌的结构区域,并命名为“CuppedHand该区域主要由两个疏水结构a6/a7环和“greasypalm”构成,存在卟啉的结合位点(al2005;Verdeciaetal2005)。酶促动力学分析表明,GUN4能够提高卟啉底物转化为离子螯合卟啉产物的效率,并且在低浓度卟啉的情况下,能够降低其反应所需镁离子的浓度(al2005),Zhou等通过体外实验进一步证明了GUN4能够极大地增强镁离子螯合酶的活性,且GUN4蛋白C端的9或10个氨基酸残基对激活镁离子螯合酶活性具有重要意义(Zhouetal2012)。图5GUN4蛋白手掌型结构示意图(Verdeciaetal2005)’s“CuppedHand’’Architecture:..华中农业人学2013届硕士研究牛学位(毕业)论文在蓝细菌和拟南芥中,GUN4被发现能够与镁离子螯合酶H亚基相结合fSobotkaetal2008;Adhikarietal2011),调节H亚基的活性,促进其与叶绿体膜的结合(Adhikarietal2009)。除此之外,GUN4还被报道参与植物血红素的生物合成(Wildeetal2004;PeterandGrimm2009)。,在各种植物生物代谢途径中还担任着各自不同的角色。拟南芥中编码镁离子螯合酶H亚基的基因为gun5,其突变体表现出基因解偶联现象,说明H亚基参与叶绿体和细胞核之间的信号传导(Suseketal1993;Strandetal2003)。同样镁离子螯合酶D亚基和chlil/chlilchli2