重组毕赤酵母表达水蛭素发酵工艺の研究.pdf

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血酶活化【lo】。此结果提示水蛭素可用于DIC治疗。,难以获得大量高纯度的样品来满足研究和应用的需要,而当水蛭素作为一种治疗药物的前景比较明确时,这种矛盾更加明显。因此,学者们开始研究水蛭素的重组表达的生产技术。大肠杆菌表达系统和酵母表达系统是目前研究水蛭素普遍采用的方法。在大肠杆菌中的表达DodtJ等【1I】应用碱性磷酸酶信号序列在太肠杆菌中表达水蛭素。作者首先合成一个为大肠杆菌碱性磷酸酶(PHOA)信号肽编码的DAN片断。,在此信号肽的末端紧随Hind酶切位点。将化学合成的水蛭基因插入此酶切位点中,在半乳糖苷酶启动子的控制下,该融合蛋白得到表达,并分泌到太肠杆菌的周胞质中。Bergmann掣121应用化学合成的寡聚脱氧核苷酸,通过酶连接得到水蛭素基因,在大肠杆菌中,通过乳糖启动子的控制,水蛭索的合成基因与半乳糖苷酶一起作为一个融合蛋白而表达,或者在启动子控制下,作为一个非融合蛋白表达。此非融合蛋白表达产物同样具有水蛭索的生物活性。Harvey等/”】最先应用医用吸血水蛭素头部提取其总RAN,经逆转录获取水蛭索的cDAN,此水蛭素基因在噬菌体PL启动子控制下,在大肠杆菌中表达具有生物活性的水蛭素。关于水蛭素基因的化学合成法的研究,Fortkamp等【14】合成了7个寡聚脱氧核苷酸配对链,将其装配成完整的水蛭素基因。将水蛭素基因融合到一个经修饰的噬菌体的cI表达基因上去,形成一个杂交蛋白,融合点处的蛋氨酸可用溴化***将活性水蛭素裂解下来。曹凡杰等115】将HVl基因克隆到pEZZ318表达载体,转化EcoliJM109菌株,IPTG诱导表达,表达上清的抗凝血酶活力达到47ATU/ml。毕群等06]利用递归PCR合成水蛭素基因,—HI中,然后转化到大肠杆菌DH5a中,重组水蛭素被分泌到细胞周质和培养液中,诱导15小时后,细胞周质中水蛭素的抗凝活性为150ATU^Ill,培养5:..重庆大学硕士学位论文1综述液中的抗凝活性为30ATU/ml,%。吴洁tn7】等设计并构建了水蛭素相关肽与天冬酰***酶C端融合的表达系统,获得表达质粒ped—,并转化EcoilBL21,获得样品比活性为50ATU/mg。在啤酒酵母中的表达Loison等【l8】首次将HV-2在酿酒酵母中表达,其采用酵母信号肽Ct接合因子将HV2分泌至胞外。将成熟的水蛭素编码序列整合到酵母Mt'ml基因前序列框架中,对酵母培养基上清液中蛋白质的分析表明,水蛭素能有效地分泌表达。按水蛭素HV2的氨基酸序列,申同健等【I9】设计并合成了水蛭素基因,并在酵母伍因子表达系统中表达。最终,在丰富培养基中诱导培养36-48小时后,【20】采用GALIO作为启动子,Mfal作为信号肽,用控制稀释速率来连续发酵表达水蛭素,,水蛭素的最大表达量可达59mg/L。Rao等【2ll在5升的发酵罐中,研究了乳糖的不同补加方法对水蛭素在啤酒酵母中的不同表达量,最后确定采用逐步法补加乳糖,。次年,他们瞄1又研究了培养基中氧浓度对水蛭素降解的影响。通过实验分析,确定当培养基中氧浓度提高到40%时,诱导培养60小时后才发现水蛭素有降解情况的发生,而培养基中氧浓度在20%时,诱导培养48小时侯后就发现了水蛭素的降解情况。Kim等印】使用转座子6序列中的Tyl和URA3将HV基因整合至酵母染色体上,拷贝数为5到10个。增加拷贝数后水蛭素的表达量可提高一倍以上。为了提高水蛭素在啤酒酵母中的表达量,Kim等1241研究了在GALl启动子控制下,采用增大拷贝数和协同表达BiP来考察对水蛭素表达的影响。结果发现,当拷贝数为10时,协同表达BiP后,水蛭素的表达量可提高到36mg/L,是单拷贝直接表达水蛭素的205倍。而后,他们瞄l又以葡萄糖不同的补加速度来考察对水蛭素表达的影响,通过研究后,,。由此可见,启动子、特殊养分(乳糖等)的适时添加、培养基的氧浓度、基因拷贝数的扩增等因素对提高水蛭素表达量起到显著作用。在甲醇营养型酵母中的表达Rosenfeld等【26I在5升的发酵罐中,使用基础盐培养基,通过诱导条件(培养pH为5,诱导pH为3)的优化,通过65小时的诱导培养后,细胞密度达到451∥L,,L;Kim等127l在5L的发酵罐中,向水蛭素Hansenulapolymorpha工程菌的培养基中添加l%(V/V)的豆油,诱导培养155小时后水蛭素的最高表达量可达320mg/L。Kim等【2s】在5L的发酵罐中,研究了在醇氧化酶为启动子的情况下,不同Hansenulapolymorpha宿主菌、甘油、酵母提取物、脂肪酸以及维生素E对水蛭素的表达量。通过实验分析,最终确定,采用月=6:..重庆大学硕士学位论文l综述DLl—005作为宿主菌,培养基的成分为50班甘油,40evE酵母提取polymorpha物,10g/%,培养60小时后,甘油和甲醇同时加入培养基中,让培养基中甘油的终浓度稳定在l一2∥L,%(V~),经过160小时的诱导培养后,水蛭素的最高表达量可达215mg/L。Kim等【29】研究了甲醇的补加量对水蛭素表达的影响,,。Zhou等【30】研究了在甲醇诱导阶段,控制工程菌的比生长率(),可有效的降低了水蛭素的降解,。莫炜等【3l】构建了重组双功能水蛭素(binat-,r_RGD—Hirudin),种子菌经过3d发酵培养,通过纯化,获得纯度大于97%,表达量为1g,L的水蛭素。Yang等【32l通过对NH4+浓度的控制(在发酵初始阶段让NI-h+,在生长阶段让NH4+),∥L。Xiao等【33】在毕赤酵母工程菌发酵过程中,添加10mM的维生素C,使工程菌的成活率从74%提高到83%,,L。。瑞士Novatis公司开发的Revasc(Desirudin)于1997年在欧洲上市,用于预防手术后深部静脉血栓(DVT)的形成;德国HoechestMarionRoussel公司的Refludan(Lepirudin)将HVl的N端第一位I(1ie)改变为L(Leu),生产第二位为T(Thr)、63位为Tyr(Y)的脱硫水蛭素变异体——Lepirudin(化学名:Lcul,,商品名REFLUDAN雪),该产品于1997年在欧洲上市,1998年在美国上市,用于治疗肝素诱导的血小板减少症(Heparin—inducedThrombocytopenia,HIT)。Biogen公司采用标准的固相合成法合成一种由20个氨基酸残基组成的水蛭素类似物——-Himlog(Bivalimdin),被批准用于高危的PTCA,防止术后再狭窄。国内有多家机构在开发重组水蛭素和其类似物/衍生物。(念珠酵母属)、Turolopsis(球拟酵母属)、Hansenula(汉逊酵母属)和pichia(毕赤酵母属)四类。其中研究最多的是只砌缸pastoris。Pichiapastoris表达系统早在70年代初期就被用来生产单细胞蛋白(SCP),但其真正应用于生物技术还是在80年代初,Philipspetroleum公司与SalkInstituteBiotechnology/IndustrialAssiciate公司合作开发P/ch/apastor/s系统来表达外源蛋白,1993年Philipspetroleum公司将Pichiapastoris表达系统的专利转让给7:..重庆大学硕士学位论文1综述Re嬲earchCoporationTechnologies公司,并委托Invitrogen公司代理,从而开启了Pichiapastoris表达系统的商业化应用。经过不断的研究发展,Pichiapastoris表达系统也日趋成熟,因此近几年被广泛的用于外源蛋白的表达,使得该系统成为目前研究最多、应用最广泛的真核表达系统之一。到目前为止,已成功表达了500多种来自病毒、细菌、真菌动植物和入的蛋白1341,还成为几种蛋白结构基因组开发的平t35][361。这源于它不但具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点,还具有原核生物表达系统所不具有的对外源蛋白的翻译后修饰等特点(如糖基化、蛋白磷酸化等);也避免了酿酒酵母(haromycescerevisiae)分泌效率差、过糖基化、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷,同时它比哺乳动物细胞更易于操作控制、易于培养、成本低、可以高细胞密度培养。在蛋白质表达方面还具有以下几个其它表达系统所不可比拟的优点:①强有力的乙醇氧化酶(Alcoholoxidase,AOX)启动子,受甲醇严格诱导调控而表达外源蛋白;②能将目的蛋白分泌到胞外并进行翻译加工,可以对表达蛋白进行糖基化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、脂类酰化等一系列的翻译后修饰,使其表达的蛋白具有天然的生物活性;③表达量高,Hasslacher等[371在胞内表达巴西三叶胶***水解酶达到了22∥L;④表达方式灵活,外源基因的表达产物既可存在于胞内,又可通过其特有的信号肽Ⅱ.MF因子或天然蛋白自身的信号肽分泌至细胞外;⑤其自身分泌的蛋白非常少,这大大简化了分泌蛋白的纯化工作;⑥外源基因通过同源重组整合到宿主菌的染色体上,重组子表达系统十分稳定;⑦糖基化程度低,毕赤酵母中加到外源蛋白每条侧链的平均长度为8~14个甘露糖残基,较之酿酒酵母每条侧链平均50~150甘露糖残基要短得多,因而更适合表达用于治疗用途的外源蛋白。^:..重庆大学硕士学位论文l综述续上表除了MCl00—3外(MCl003菌株的AOXl和AOX2都缺失,所以不能在含甲醇的培养基上生长),其他均为甲醇诱导型,在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上,宿主菌的AOX基因受到抑制,当甲醇作为唯一碳源时,可强烈诱导AOX基因表达。SMDl168和SMDl168H菌株缺失肽酶A(PeptidaseA,pep4)。PEP4激活羧肽酶Y(CarboxypeptidaseY)和蛋白酶B1(ProteaseBl),因此在SMDl168和SMDll68H中缺少羧肽酶Y和蛋白酶B。菌株KM71、GSll5和SMDll68缺失组氨酸脱氢酶基因(HistidineDehydrogenaseGene(his田),其不能合成组氨酸脱氢酶,因此只能在含有组氨酸的培养基中生长。GSll5和SMDll68有完整的AOXl基因,在甲醇培养基上表型为Mut+(甲醇利用表型);菌株KM71的AOXl基因被4R国基因替代,所以它只能依赖AOX2基因合成AOX。虽然AOX2和AOXI有97%同源性,但AOX2利用甲醇的能力远比AoXl弱,在甲醇培养基上表现为Muts(甲醇利用慢表型),其转化子也是Mutj,表型不必鉴定。在实验过程中,可以通过MDfMDH)和MM(MMH)平板筛选来鉴定Muts和Mut+表型。,这些载体都属于穿梭载体,在大肠杆菌中复制,然后线性化重组质粒,以同源重组的方式整合至tJPichiapastoris启动子下游和转录终止子之间。表达载体主要由启动子、终止子、选择标记、报告基因、复制起点等元件构成,对分泌型载体还需要信号肽序列。Pichiapastoris表达载体可分为分泌表达型和胞内表达型,其中pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1和pPICZa为分泌型表达载体,而pA0815、pHIL-D2和pPICz为胞内型表达载体。由于Pichiapastor妇没有稳定的附加体质粒,因此一般采用整合型质粒作为外源基因的表达载体。通常整合的区域为HIS和AOXI。而整合又分为单交换和双交换(—)。一般情况下,整合到酵母染色体上的基因拷贝数越多,蛋白表达量就越高。多拷贝发生在AOXl或HIS基因位点,但同一位点同时插入多个基因的几率仅占His+转化体的1%~10%,为此,人们根据不同表达载体的组成特点,又发展了可以快速筛选高拷贝整合的载体,如p