WB常见问题的解答.pdf

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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。:..WesternBlot详解Western免疫印迹(WesternBlot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下WesternBlot技术:一、原理二、、主要试剂四、主要步骤五、、:..、原理与Southern或Northern杂交方法类似,但WesternBlot采用的是聚丙烯酰***凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如***纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。三、主要试剂1、丙烯酰***和N,N’-亚甲双丙烯酰***,应以温热(以利于溶解双丙稀酰***)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰***和1%(w/v)N,N’-亚甲双丙烯酰***储存液丙稀酰***29g,N,N-亚甲叉双丙稀酰***1g,加HO至100ml。)储于棕色瓶,4℃避光保存。,2:..因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月,隔几个月须重新配制。如有沉淀,可以过滤。2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v),1mlHO去离子水配制,室温保存。23、分离胶缓冲液:-HCl():,加水稀释到100ml终体积。过滤后40℃保存。4、浓缩胶缓冲液:-HCl():,用约48ml21mol/。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备,再用HCL调节PH值,。5、TEMED原溶液N,N,N’N’四***乙二***催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰***的聚合。PH太低时,聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸***溶液。提供两种丙稀酰***聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml,、SDS-PAGE加样缓冲液:,,10%,,%,HO32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白2质样品混合,在沸水终煮3min混匀后再上样,一般为20-25ul,总蛋白量100μg。7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:,188g甘氨酸,10gSDS,用蒸馏水溶解至1000ml,-。临用前稀释10倍。8、转移缓冲液:配制1L转移缓冲液,、、,并加入200ml甲醇,加水至总量1L。9、丽春红染液储存液:丽春红S2g三***乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。:..10、脱脂奶粉5%(w/v)。11、%叠氮钠(有毒,戴手套操作),溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCl(),500mmol/LnaCl。13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、过氧化物酶标记的第二抗体。15、NBT(溶于70%二***甲酰***,75mg/ml)。16、BCIP(溶于100%二***甲酰***,50mg/ml)。17、100mmol/LTris-HCl()。18、100mmol/LNaCl。19、50mmol/LTris-HCl(),5mmol/LEDTA。(可以参看分子克隆)四、主要步骤生物秀为您搜集了现阶段几乎网上所有的WesternBlot的中英文资料,仅供实验参考,可以根据自己实验的实际情况进行调整:WesternBlotPROTOCOL;五、实验常见的问题指南根据问题的类型主要分成以下几类(以下资料权作参考,请勿盲目模仿!);:..?解答:《抗体技术实验指南》和Antibodies(alaboratorymanual,wrotebyEdHarlow,davidlane)两本书不错。(以下简写成WesternBlot),提取线粒体后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用的博士德的一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120μg,换了个santacloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗?解答:怀疑是样品问题,可能是:1,样品不能反复冻融;2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时,建议检查WesternBlot过程,提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说,一般加PMSF就可以了,最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。?解答:当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品。,操作需要注意什么?解答:如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂就要温和得多,这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。E我的样品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上,就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡了,有什么办法可以解决?:..解答:你可以加大上样量,没有问题,还有转移时你可以用减少电流延长时间,多加5-10%甲醇。,SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适?积层胶的浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作WesternBlot吗?解答:260kd的蛋白不好做,分离胶用6%,%。,要用什么方法来增加上样量?如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。解答:可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,。?解答:-80℃,一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。,%,但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11%的配方,不知为何?解答:上述您提到的两种凝胶均可以使用,因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内,但需注意条带位置。:..,二抗是生物素化的多克隆抗体,三抗是亲和素生物素体系,不知采用这样的方案后,封闭液是否要作调整,能否再用5%的脱脂奶粉呢?好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成,是吗?解答:不能使用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含生物素,,一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗?解答:WesternBlot一般上样30-100微克不等,结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系,也与显色时间长短有关。开始摸条件时,为了拿到阳性结果,各个步骤都可以量多一点时间长一点,当然背景也就出来了。要拿到好的结果,如果抗体好的话比较容易,抗体不好的话就需要反复地试了,当然有的不适合WesternBlot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。,处理样品有什么诀窍吗?还有,您用过大牛血清做封闭剂吗?浓度如何?效果是不是比BSA好一点?解答:必须进行研磨、匀浆、超声处理,蛋白质溶解度会更好,离心要充分,膜蛋白需用更剧烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF和蛋白酶抑制剂cocktail),封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体,使用BSA也是不错的选择。,在做western要注意什么呢?解答:做200kd蛋白的WesternBlot时要注意,分离胶最好选择>7%的;剥胶时要小心;转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)。?:..解答:可以浓缩样品;增大上样体积来增大上样量。,膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机,有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法,42kd的蛋白分子量算不算大?解答:如是需要提取膜蛋白,(而不是只需要提取膜蛋白),可以用Ripabuffer提取膜蛋白和胞浆蛋白,用这个做WesternBlot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd不算大,也不算小,所以,可以按照一般的转移方法实施。?解答:上样量要根据实验的要求来定,如果要求是定量和半定量的WesternBlot则上样量要均等,如果只是要定性,则没有太大的关系,尽量多上就行了,。,二抗的比例是否重要?解答:比较重要,调整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特异的本底。,要做磷酸化某因子WesternBlot,其二抗有何要求?解答:对二抗无要求,要看你实验条件来选择,一般推荐用HRP标记的二抗。,所以没做预试,怕费时间,用什么样的稀释度比较好呢?我用的ELL+plus试剂盒显色。转膜过夜,一抗孵育也是过夜的,若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。:..解答:不同抗体,即使是同一公司的抗体,其最佳的抗体稀释度也是不一样的,需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧,转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦,何必浪费时间呢。至于具体的转膜时间,还要看你的目的蛋白分子量的大小;转膜的设备,是半干式,还是湿式。一抗当然可以过夜,如果你想所短WesternBlot时间的话,可以增高一抗的孵育温度,我们实验室一般37度,两小时就足够了;你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度,你可以一抗1:1500;二抗1:20000试试。另外建议你洗膜时,多洗几次,最好是在封闭;一抗和二抗后至少是5x5min,跑一张好膜不容易,多尽点心吧,这样不会浪费你的时间,只会节省你的时间!?解答:免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称表位),有些表位是线性的,而有的属于构象型;线性表位不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;构象型表位由于受蛋白空间结构限制,煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。(限于单抗):抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但是如抗体比较珍贵,可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用,4度保存,避免反复冻融。、?:..一种固相支持物,价格最便宜;膜介于二者之间。就结合能力而言:尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480-2,可结合短至10bp的核酸片段;***纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80-100μg/cm2,对于200bp的核酸片段结合能力不强;PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125-300μg/cm2。就温度适应性而言:尼龙膜经烘烤或紫外线照射后,核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合;***纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA,结合不牢固;PVDF膜结合牢固,耐高温,特别适合于蛋白印迹。就韧性而言:尼龙膜较强;***纤维素膜较脆,易破碎;PVDF膜较强。就重复性而言:尼龙膜可反复用于分子杂交,杂交后,探针分子可经碱变性被洗脱下来;***纤维素膜不能重复使用;PVDF膜可以重复使用。,PBDF膜用甲醇浸泡的目的?解答:PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。?解答:可以。,为什么大蛋白分子的一端(即点样空的一侧)的转膜好象不是很好,为什么?解答:这是正常的,大分子的蛋白转移的慢,你延长转移时间和电流,大分子一端就会好的多,但是小分子的就有可能会变淡。,还是用上样缓冲液?解答:用上样缓冲液,这样有几个好处,可以提取总蛋白,同时又可以让磷酸化酶失活。:..tanksystem有什么讲究?解答:建议低电压,长时间,(一般tankSystem用衡压好点),如28V14-16hrs。,同样的抗体免疫组化能做出,而WESTEN却不能?解答:这多半是抗体的问题,要看抗体的说明,是否能做WesternBlot和IHC。?解答:一般用甲醇泡泡就可以了。×8转印膜,要加多少一抗?解答:一抗的稀释度是有说明的,根据你的一抗看看就知道了,但是那么大的膜孵育体积一般最少为3-5ml。,怎样才能达到最佳效果。解答:无要求。”是什么原因呢?是有的成分不对吗?解答:没什么问题,就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来,在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜,胶里的水分被蒸发,采用保鲜膜包上也可以;也可能母液(30%聚丙酰***)有问题,你可以重新配制一份观察;能够替换的试剂,尽量换一下,选用好的试剂,避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。、滤纸、胶大小有何讲究?:..分别比胶小-2mm,而膜的长宽分别比胶大1-2mm。绝对禁忌:上下两层滤纸因为过大而相互接触,这样会短路,电流不会通过胶和滤纸。,如要分离小21KD,中至66KD,大至170KD,可以一次做好吗?解答:这么广的分布不好转移,一般建议:21kd和66kd可以一起转,12%SDS-PAge,湿转36V,3-5hrs就可以了,可以根据你实验室的经验调节;170kd用7%SDS-page,48V10hrs-16hrs。,转移效率低怎么样解决?解答:可以考虑:转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度)(优化的转移缓冲液,可以参考《蛋白质技术手册》),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋白质和NC膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;%SDS,也是为了增加转移效率;用优质的转移膜,或使用小孔径的NC膜();使用戊二醛交联;低浓度胶,如低至6%。太大时还可以考虑用琼脂糖胶;提高转移电压/电流;增加转移时间。?解答:蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。选择质量上层、合乎要求、方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素,我们要量体裁衣,从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。:..:***纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下,大多数带负电荷的蛋白质会与***纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起,虽然这其中的机制还不是十分清楚,但由于***纤维素膜的这个特性,而且易于封闭非特异性结合,从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下,结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小,要选择不同孔径的***纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于,蛋白的转移就很难进行了。因此,***纤维素膜。,,“Blowthroμgh”的现象。从膜的质地上来看,最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。***纤维素膜的结合能力主要与膜的***纤维素的纯度有关,市场上有些***纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素,因而降低了蛋白的结合量。S&S公司采用的是100%纯度的***纤维素,保证了最大的蛋白结合量,可达80-150μg/cm2。由于100%的纯度,因而也大大减少了非特异性的结合,降低杂交背景,无需高严谨度的洗脱步骤。其次,膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的***纤维素膜比较脆,漂洗一两次就会破损,不能反复使用。转移膜:PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质,通常是用来制造水管的。PVDF膜可以结合蛋白质,而且可以分离小片段的蛋白质,最初是将它用于蛋白质的序列测定,因为***纤维素膜在Edman试剂中会降解,所以就寻找了PDVF作为替代品,虽然PDVF膜结合蛋白的效率没有***纤维素膜高,但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品,一直沿用至今。PVDF膜与***纤维素膜一样,可以进行各种染色和化学发光检测,也有很广的适用范围。这种PVDF膜,灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高,非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。离子交换型转移膜:***纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的,还有一类膜是根据离子交换的方式结合生物大分子的。由DEAE(二乙氨乙基)修饰的纤维素制成的DEAE阴离:..可以有效的结合阴离子基团,包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10以下,DEAE基团都能带电荷,在低离子强度的转移液中结合蛋白分子。其最适的pH环境为5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的研究。这种孔径的DEAE膜,除了可以做WesternBlotting外,还可以用于核酸结合研究。还有一种离子交换型膜是羧***()修饰的纤维素膜,它可以结合蛋白和多肽分子,以及其他的一些带正电荷的样品,最适结合pH范围在4-7。结合的多肽分子可以从CM膜上洗脱下来,用于氨基酸系列分析或微测序。(BIO_RAD),但是电泳总跑不全8条带,请问什么原因?怎样改善?胶用过8%,10%,12%,都是这样。marker是新买的。解答:一般来说,是小分子量Marker跑走了,增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。,75kd,45kd,30kd,20kd,10kd组成的marker。开始做WesternBlot时还能够看到marker,当然也仅能看见其中最多三条带。用80V进行SDS-PAGE电泳,用恒压10V45min转印的。前几次做WesternBlot时没有进行丽春红染色,但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析,用培养基样品进行分析,没有用间接法,而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体(Anti-V5-HRP)。但就是出不来结果,我很茫然。谢谢您过给予指点!:..、我用的是RochemolecularBiochemicals公司的由100kd,75kd,45kd,30kd,20kd,10kd组成的marker。开始做WesternBlot时还能够看到marker,当然也仅能看见其中最多三条带。”有的时候,PrestainedMarker放久了效果就会变差,电泳是条带不清晰,扩散。但是你的问题可能还有其他的方面的问题,可能是蛋白跟膜结合的不紧密。转移是多加点甲醇。2、“前几次做WesternBlot时没有进行丽春红染色,但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。”转移时半干法建议用恒流,你这样的也就30kd-50kd的转移地比较好。3、“再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析,用培养基样品进行分析,没有用间接法,而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体(Anti-V5-HRP)。”是否检测了表达量,二抗是否是好的,你做了阳性对照?。?解答:(1)阴离子染料是最常用的,特别是氨基黑,脱色快,,考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度,但脱色慢,背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去,以便进行随后的氨基酸分析。缺点是:溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。(2)胶体金,灵敏度高,检测范围可到pg级,但染色比稳定。(3)生物素化灵敏度位于1、2之间,可用于任何一种膜。:..?解答:对于发表文章的实验最好加内参,实验严谨。?解答:分析一般的结果没问题。?解答:可以选用组蛋白,组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的,有很多都可以当成内参,在网上查查就可以选出你要的内参。,,一般1小时左右?解答:不是的,半干法推荐用恒流,一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间。,内参B-actin,GAPDH,那个好?解答:选用beta-actin就可以。,所用的防沫剂A是什么?还有Tris-HCl是不是就是用Tris和盐酸配出来的呢?解答:转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉。Tris-HCl就是Tris盐用HCl调ph值,配置而成。:..,蛋白质位于细胞核中,请问此蛋白质的提取液及操作方法是?每一步都必须要低温吗?这种蛋白质是磷酸化的蛋白质,操作时如何防止去磷酸化的发生?解答:可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白,可以加NaF防止去磷酸化。?受不受组织来源的影响?胞膜和胞浆有区别吗?解答:一般来说提取时加入光谱的蛋白酶抑制剂就可以了,操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法,一般来说都没有区别。,不但没阳性结果,显色背景都没有,电泳和转膜都染过,有条带。底片和显色液及DAB显色液均试过,没问题。1、检测GAD--分子量67kd,提取液有蔗糖,其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把?样本--20度放置一周内测。2、一抗放置2年,可能效价不高!用的是1:100。如果是一抗的原因,不会背景都没有把?3、第一次有不均匀背景,因为一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。4、封闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST,漂洗液用的是含1%BSA的TBST液,TWEEN-%,不会是封闭液的问题吧?解答:可以在下面几个问题上找找原因。%Milk,漂洗液(washingbuffer用TBST),降到1:20。。?解答:加甲醇起着一定的固定作用,因为小分子蛋白质容易转出去.(特别是在***纤维素膜上,因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。:..ZZ.“转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”,其中TBST最后那个T是Tween吗,浓度多大?解答:是Tween,配方如下:Tris-ween-20(TBST),,,and3gofTrisbasein800mlofdistilledH2O,Add500ulofTween-20,,AdddistilledH2Oto1L,,一抗,二抗时的温度有没有什么规定呢,比如现在我就在室温里做,或者要在4度下?解答:均可在室温进行,如果时间不够,一抗孵育可以先在室温进行一个小时,然后4度过夜。?另外有过用尿素和硫脲提取膜蛋白吗?配方如下:7M尿素,2M硫脲,Triton-x-,新鲜加入:65mMDTT蛋白酶抑制剂:试剂盒HaltTMProteaseinhibitorcocktailkit1%(v/v)是用于抽提双向电泳用蛋白的配方。不止用于抽提细胞全蛋白(主要是想得到其中的膜蛋白)是否可行?改良的RIPA裂解缓冲液(,50mmol/L,;NaCl,150mmol/L;NP-40,1%;脱氧胆酸钠,%;SDS,%;EDTA,1mmol/L;PMSF,1mmol/L;Leupeptin,2μg/ml)不知对于膜蛋白效果如何?此外该方中的EDTA,是否用做蛋白酶抑制剂?解答:做2-D对不推荐使用NP-40(因为即使进口的NP-40也不纯,,其中的杂质会影响质谱结果)。对于动物细胞,其蛋白酶活性较弱(相对于组织和大肠杆菌等),可以不使用cocktail,因为7M尿素+2M硫脲+4%CHAPS构成的变性环境已经足以抑制大部分蛋白酶的活性,2M硫脲+4%CHAPS对于抽提膜蛋白有很大的帮助,不过如果您专职做膜蛋白建议采用分级抽:..提法。此外还可以采用梯度离心法和一些基于去垢剂的方法。EDTA用于灭活金属蛋白酶(主要是其鏊合作用)。加过多的蛋白酶抑制剂可以导致蛋白质的修饰,做WB无所谓,做MAILDI时会给正确鉴定带来麻烦。裂解缓冲液中少了***电解质(在2-D裂解缓冲液中,***电解质起的作用:提供连续的PH梯度,从很大程度上增加蛋白质的溶解性;还可以去除一部分核酸);也不推荐采用SDS,因SDS会与蛋白质结合导致其等电点发生改变,如果您实在要用,%以