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实验六胰蛋白酶活力的测定
(先打开水浴锅,温度设置成40摄氏度)
一、实验目的
二、实验原理
三、器材仪器和主要试剂
四、实验操作
五、思考题
一、实验目的
掌握定量测定蛋白酶的活性的方法,了解本实验的酶、底物和生成物的相关性质,以及本反应的环境条件。
进一步理解酶活力和比活力的概念
巩固比色法测定物质含量的基础,掌握721型分光光度计的原理和使用方法,学****绘制标准曲线的方法
二、实验原理
,它将酪蛋白水解成酪氨酸等物质。
,是磷钨酸和磷钼酸的混合物,它在碱性条件下极不稳定,可被酚类化合物还原产生蓝色(钼蓝和钨蓝的混合物,680nm)
,从而推导出酪氨酸的量,根据生成物的含量可以计算胰蛋白酶的活力。
:在40C,,水解酪蛋白每分钟产生1 g酪氨酸为1U。
三、器材仪器和主要试剂
721 型分光光度计
Folin 试剂甲液,乙液
% 酪蛋白
100 μ g/mL Tyr 溶液
四、实验操作
1、酪氨酸标准曲线的制作
以酪氨酸的μg数为横坐标, A680nm为纵坐标,作出标准曲线。
管号
1
2
3
4
5
6
样品
Tyr 100g/ml(ml)
0





水(ml)





0
稀释后Ty(μg/ml)
0
20
40
60
80
100
Na2CO3(ml)
5
5
5
5
5
5
酚试剂(ml)
1
1
1
1
1
1
迅速混合,于40℃放置15分钟
A680nm
调0
管号
样品滤液(ml)
对照滤液(ml)
水(ml)
碳酸钠溶液(ml)
混匀
酚试剂(ml)
混匀
1(样品)
1
---
---
5
1
2(对照)
---
1
---
3(调零)
---
---
1
40℃,15min显色。用3号管调零,在A680nm处测1号样品管和2号对照管的光吸收值.
胰酶活力单位定义:
规定在 40 ℃, 的条件下,水解酪蛋白每分钟产生酪氨酸 1 微克为一个酶活力单位。1g 蛋白酶在 37 ℃, 的条件下所具备的总活力单位为:
( A 样— A 对)× K × V/t × N
A 样:样品液光吸收值;
A 对:对照液光吸收值;
K :标准曲线上光吸收为 1 时的酪氨酸微克数;
t :酶促反应的时间(分),本实验 t =10 ;
V :酶促反应管的总体积(毫升数),本实验 V =6 ;
N :本次实验酶液的稀释倍数:3500
五、思考题
酶的试验为何设对照又要设空白
稀释的酶溶液是否可长期使用?说明原因。
如何保证本实验测定数据的准确性?