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鸡痘病毒双基因表达载体(pg7.5n)的制作方法.docx


文档分类:医学/心理学 | 页数:约15页 举报非法文档有奖
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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。鸡痘病毒双基因表达载体()的制作方法专利名称:鸡痘病毒双基因表达载体()的制作方法技术领域:本发明属于生物技术领域,具体涉及一种鸡痘病毒双基因表达载体、其构建方法及应用。背暴技术痘病毒科是一大群、专性的病毒,直径300~400nm,脂质蛋白外壳,包绕着一个复杂的核心结构此结构含有一个线性近20kb双链DNA分子,编码多个亚单位,DNA依赖的RNA聚合酶,转录因子,帽结构和***化酶,多聚A聚合酶,都在病毒核心中包装,并转译成mRNAs。鸡痘病毒(FowlpoxVirus,FPV)属痘病毒科禽痘病毒属。病毒粒子核心含有双股线状DNA,G+C=35%,基因组长约300kb。其自然条件下只能感染禽类,但能对哺乳动物细胞产生流产性感染,不产生有感染性的病毒粒子,但能表达、提呈FPV表达的蛋白,刺激机体产生对FPV表达蛋白的免疫。因此FPV不仅可以作为禽类基因工程活疫苗载体,而且可以作为哺乳动物非复制型活疫苗载体。、目前,现有的鸡痘病毒载体还不完善,如载体太大,可载的外源基因长度有限,可用的酶切位点不多,操作繁瑣。而且,双基因表达载体多为顺式表达,对第二个基因的表达量有一定的降低。发明内容本发明的目的在于提供一种鸡痘病毒双基因表达载体();本发明的另一个目的在于提供上述载体的构建方法;本发明的再一个目的在于提供上述载体在真核表达和构建重组病毒基因疫苗中的应用。,、LacZ基因、位于LacZ基因上的多克隆位点、稀有酶切位点Not1、鸡痘病毒DNA同源臂F11L1和F11L2、AmpK抗性标记基因、复制起点(ori)。其中F11L1和F11L2为载体的同源臂,F11L1的跨度是2169-2637,长为468bp;F11L2的跨度是3082-3592,长为510bp;Amp+ori的跨度是1-2168;Notl跨度是2638-2646;-3068。F11L基因为痘病毒的非必需基因,长约1000bp。对于上述的抗性标记,其还可以为Kai^或Te^等抗性标记基因。本发明还提供了构建上述载体的方法,其包括如下步骤1)以pGEM4z为模板,Amp+oriF和Amp+oriR为引物,扩增出pGEM4z的Amp+ori片段;以鸡痘病毒DNA为模板,FllLlF和FllLl+Not1R为引物,扩增出鸡痘病毒FllLl同源臂;连接Amp+ori片段和FllLl同源臂,转化JM109感受态细胞,筛选出阳性菌落,扩大培养后抽提质粒,得到pAmp+ori+FllLlNotl;2)以pGEM4z为模板,P75LacZF和LacZR为引物,扩增出P7,5LacZ片段;线性化pAmp+ori+,转化JM109感受态细胞,筛选出阳性菌落,扩大培养后抽提质粒得到pAmp+ori+FllLlNotl+;3)以鸡痘病毒DNA为模板,PolyA+F11L2F和F11L2为引物,扩增出鸡痘病毒F11L2同源臂;线性化pAmp+ori+FllLlNotl+,转化JM109感受态细胞,筛选出阳性菌落,扩大培养后抽提质粒,即得到鸡痘病毒双基因表达载体。上面所述的引物分别是Amp+oriF:5,gcgtaatcatggtcatagc3,Amp+oriR:5'acgtcaggtggcactttt3,P7,5LacZF:5,aag3,LacZR:5,ctatgcggcatcagagca3,F11L1F:5'3,FllLl+NotlR:5'gcgcattacgtgttgtttgtt3,PolyA+F11L2F:5,***a***幼3犯gat33tttctgcto3'F11L2R:5,cttctttagaggaaatcg3,上述表达载体,与鸡痘病毒重组后,可以获得重组病毒FPV-,其在含有X-gal的培养基上培养呈蓝色。重组病毒经过装有目的基因的表达载体穿梭后(装有目的基因的两臂之间的片段相交换),挑选白色蚀斑,经纯化的白色蚀斑即为可以表达目的基因的重组鸡痘病毒。该重组病毒除了表达目的基因外不表达其他外源性蛋白,可以降低接种重组病毒后机体的应激反应。上述重组病毒FPV-PG7,5LacZ亦可作为病毒载体。该重组病毒,具有GC含量高的Notl稀有酶切位点,由于痘病毒本身基因组长度为260kb-280kb,该病毒可以装载比较大的DN***段,还可以用作装载在细菌内不稳定的DNA序列。,将该穿梭载体穿梭鸡痘活疫苗(I)纯化出蓝色蚀斑病毒,之后再将另一个目的基因装入已经在Notl装上一个目的基因的表达载体的多克隆位点上,将这个质粒与之前纯化的篮斑毒再重组,挑取白色蚀斑,纯化后的白色蚀斑毒即为可以表达两个基因的重组痘病毒。并且,上述连接有??0^八尾巴的目的基因片断具有一定的灵活性,,并且可以反向插入到载体中,采用反式表达的方法提高表达效率。本发明构建的双基因表达载体,最大限度地减少了载体长度,从而可以容纳更大的外源基因;增加了可用酶切位点数量,方便克隆不同的外源基因;对插入位点Notl处的启动子不作限定,可以自由选择与外源基因搭配的启动子,可以用于启动子效率的评估,从而可以提髙表达效率;采用反式表达的方法,从而提高了外源基因的表达效率。附图l是本发明实施例l表达载体的结构示意图,图中F11L1、F11L2表示同源臂,AmpK是卡那霉素抗性标记基因,Ori表示复制起点,P7,5是启动子,MCS表示多克隆位点;图2是PG75-S1-N质粒的构建图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步说明,但不用来限制本发明的范围。。(I)购自乾元浩南京生物制药厂。pGEM4z购自华美生物工程有限公司。6孔细胞培养板、DMEM、Opti-MEM和Lipofatami股2000购自Invitrogen。X-gal,低熔点琼脂糖,T4多聚核苷酸激酶、PrimeSTARHSDNApolymerase和DNALigationKit(MightyMix)购自Takara。GelExtractionKit和PlasmidminiKit(200)购自Omega。JM109感受态细胞购自Takam。所用引物与说明书中相同。,Amp+oriF和Amp+oriR为引物,98°C15s,50匸15s,72€2min,30个循环,扩增出pGEM4z的Amp+ori片段。以鸡痘活疫苗为模板,FllLlF和FllLl+NotlR为引物,98°C15s,50°C15s,72°C40s,30个循环,扩增出鸡痘病毒F11L1同源臂。回收Amp和ori片段和FllLl同源臂,按T4多聚核苷酸激酶的说明书搡作磷酸化FllLl同源臂的5'端羟基,按照DNALigationKit(MightyMix)说明书搡作将磷酸化的FllLl同源臂和Amp和ori片段连接后转化入JM109感受态细胞,培养14-16小时后,挑取可疑阳性菌落于含有Ampicilline的LB液体培养基中培养4小时,以F11L1F和Amp+oriR为检测引物,对可疑菌落进行菌液PCR检测,鉴定阳性菌落后,扩大培养阳性菌落后利用PlasmidminiKit(200)抽取阳性质粒,该质粒即为pAmp+ori+FllLlNotl。以pAmp+ori+FllLlNotl为模板,Amp+oriF和FllLl+NotlR为引物,98°C15s,50°C15s,72°C2min20s,30个循环,把pAmp+ori+FllLlNotl线性化。以pGEM4z为模板,,98°C15s,45°C15s,72°C40s,30个循环,,回收线性化的pAmp+ori+,'端羟基,+ori+FllLlNotl后转化入JM109感受态细胞,培养14-16小时后,挑取可疑阳性菌落于含有Ampidlline的LB液体培养基中培养4小时,以FllLlF和LacZR为检测引物,对可疑菌落进行菌液PCR检测,鉴定阳性菌落后,扩大培养阳性菌落后利用PlasmidminiKit(200)抽取阳性质粒,该质粒即为pAmp+ori+FllLlNotl+。以pAmp+ori+FllLlNotl+,Amp+oriF和LacZR为引物,98'C15s,50°C15s,72°C3min,30个循环,把pAmp+ori+FllLlNotl+。以鸡痘活疫苗为模板,PolyA+FllL2F和FllL2R为引物,98°C15s,50。C15s,72°C40s,30个循环,扩增出鸡痘病毒F11L2同源臂。回收线性化的pAmp+ori+FULlNotl+,按T4多聚核苷酸激酶的说明书搡作磷酸化F11L2同源臂的5'端羟基,按照DNALigationKit(MightyMix)说明书操作将辚酸化的F11L2同源臂和线性化的pAmp+ori+FllLlNotl+,培养14-16小时后,挑取可疑阳性菌落于含有Ampicilline的LB液体培养基中培养4小时,以F11L1F和F11L2R为检测引物,对可疑菌落进行菌液PCR检测,鉴定阳性菌落后,扩大培养阳性菌落后利用PlasmidminiKit(200)抽取阳性质粒,该质粒即为pG7,5N。,(I)的鸡胚成纤维细胞的6孔细胞培养板上,培养60小时后,收取病毒液。将病毒液感染鸡胚成纤维细胞,感染l小时后弃去病毒液,铺上一层1%的低熔点琼脂糖,培养24小时后再铺上另一层含X-gal的低熔点琼脂糖,继续培养3-5天后,挑取可疑的蓝绿色蚀斑。以蓝绿色蚀斑为模板,,对可疑蓝绿色蚀斑进行PCR检测,选择阳性蚀斑后,再经过3代的蚀斑纯化,直到所产生的蚀斑全为蓝绿色为止,将该纯化后的重组鸡痘病毒命名为FPV-。(IBV)Sl基因和NP基因在痘病毒载体中的表达与生物活性的检测为例。1、-S1-NP质粒根据Sl基因设计扩增Sl基因ORF的引物,该引物对分别带iVW/,将扩增产物转入pMD18-T载体(购自Takara),测序正确后,用iVw/酶切并和经JVof/,转化大肠杆菌ToplO(购自天根生化科技有限公司),挑选阳性菌落,提取质粒,-S1质粒。根据N基因设计扩增N基因ORF的引物,该引物对分别带有5附///和州^/肌酶切位点,将扩增产物转入pMD18-T载体,测序正确后,用Bflm///////;^///双酶切,并和经丑01////////^///双酶切后的PG7,5N连接,转化大肠杆菌ToplO,挑选阳性菌落,提取质粒,-NP质粒。用5flm////历/w////--NP,连接后转化大肠杆菌ToplO,挑选阳性菌落,提取质粒,得到PG7,5N-S1-NP质粒。上面所用的引物是NP引物M41NP1:5'CTAAGCTTCATGGCAAGCGGTAAGGCAACTG3'M41NP2:5'TAGG3'Sl引物M41S1F:5,tctt3,M41S1R:5,GCtaacgtctaaaacgacgtgtt3,2、同源重组病毒FPV282E4购自乾元浩南京生物药厂(鸡痘活疫苗1),转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen)FPV282E4接种CEF(鸡胚成纤维细胞)-S1,经IPTG+X-Gal诱导后筛选阳性重组病毒FPV-IBVS1,纯化后得到驯化的能产生蓝斑的重组病毒FPV-IBVS1。用质粒PG75N-NP转染上述重组病毒FPV-IBVS1的宿主CEF,经二次同源重组并挑选白斑获得重组病毒FPV-IBVNP;-S1-N转染上述重组病毒FPV-IBVS1的宿主CEF,经二次同源重组并挑选白斑获得重组病毒FPV-IBVS1-NP。三个重组病毒FPV-IBVS1、FPV-IBVNP、FPV-IBVS1-NP经过若干代次传代后测定其稳定性。用于对照的载体为ADe加vator购自Qbiogen,装入Sl基因及NP基因得到rAD-Sl-NP表达载体。FPV-IBVS1-NP及rAD-Sl-NP在相同条件下分别在大肠杆菌ToplO中表达。结果釆用SynGeneGeneGenius凝胶成像系统对采用表达蛋白的Westenblot纤维膜进行蛋白量估算。rAd-Sl-NP载体的第一蛋白(Sl)的表达量约为95-110mg/L,而第二蛋白(NP)的表达量约为15-30mg/L,远低于S1蛋白的表达量。,第一蛋白(Sl)的表达量为95-120mg/L,与rAd-Sl-NP载体表达量相近。但第二蛋白(NP)的表达量为85-110mg/L,远高于rAd-Sl-NP载体NP蛋白的表达量。(由于进行了三次以上的重复实验,上述数据为估算值的变动范围)序列表华南农业大学鸡痘病毒双基因表达载体()13592DNA〈213〉人工序列〈400〉aacgcgcgggg卿acagaatcagggg8t£g8C£lgg£tttgatcttt1020tctacggggtctgacgctcagtgg幼cg犯

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