香雪兰沉香醇合酶的cDNA的制作方法.docx

该【香雪兰沉香醇合酶的cDNA的制作方法 】是由【421989820】上传分享，文档一共【15】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【香雪兰沉香醇合酶的cDNA的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。香雪兰沉香醇合酶的cDNA的制作方法专利名称:香雪兰沉香醇合酶的cDNA的制作方法技术领域:本发明属于生物技术领域,具体涉及从红花香雪兰花瓣中克隆分离编码沉香醇合酶(LIS)的cDNA。背景技术:沉香醇合酶是植物单萜合酶家族的一员,它是沉香醇生物合成的限速酶,能催化单萜合酶的底物GPP(Mf)牛儿焦磷酸)生成沉香醇。沉香醇合酶催化的反应是直接接触反应,需要二价金属离子(Mg2+/Mn2+等)作为催化剂。其催化的产物沉香醇具有广阔的市场价值,被广泛应用于香料合成、食品添加剂、医药等领域。到目前为止,人们已经克隆了十几种植物的沉香醇合酶基因,如山字草((1996)1137-1148),黄花蒿((1999)143-149),朽1樣留兰香((2002)112-121),拟南芥(..(2002)730-745),番茄((2007)251-263),金鱼草((2008)224-239)等。比较不同物种沉香醇合酶基因序列发现它们之间的相似性不高,如金鱼草的AmNES/LIS与拟南芥沉香醇合酶的相似性为43%,艾蒿与山字草沉香醇合酶的相似性仅为22%。这种低相似性给其它物种沉香醇合酶基因的分离带来一定难度,使得克隆的沉香醇合酶基因仅限于少数物种,并且集中于双子叶植物和裸子植物,单子叶植物沉香醇合酶基因的克隆少见报道。目前,沉香醇合酶基因的克隆主要采用反向遗传学(即分离纯化沉香醇合酶——蛋白质N端测序——设计引物克隆基因)和正向遗传学(RACE-PCR,cDNA文库筛选、相似性克隆)等多种手段相融合的方法进行。香雪兰花香成分分析发现,沉香醇是其花香成分的主要物质,与香雪兰花香形成关系密切。本专利利用序列相似性克隆与RACE-PCR相结合的方法得到了香雪兰沉香醇合酶基因G^LIS)。该基因为单子叶植物的沉香醇合酶基因,能催化生成单一产物沉香醇。发明内容本发明首次从红花香雪兰中克隆得到沉香醇合酶(LIS)的新cDNA,并确定了它的核昔酸序列和由此得出的氣基酸序列。另外,LIS基因在表达菌株中成功的表达了所述的LIS蛋白,并且发现表达的重组蛋白在体外酶活实验中可以催化GPP生成沉香醇。所以,本发明的目的是提供编码沉香醇合酶(LIS)的新cDNA序列和由此推断的氨基酸序列。为了从香雪兰中克隆得到LIS基因,本发明首先利用其它物种萜烯合酶的保守序列设计兼并引物,采用RT-PCR的方法分离得到109bp的cDN***段,测序得到该片段的核苷酸序列。分析该序列显示此片段与植物萜烯合酶的同源性较高。利用RACE法克隆该基因的3’端序列,得到744bp的片段,测序得到该片段的核苷酸序列。分析该序列显示此片段与萜烯合酶的相似性较高。在得到3’端序列的基础上,继续采用RACE法克隆该基因的5’端序列,得到1246bp的片段,测序得到该片段的核苷酸序列。提取红花香雪兰花瓣总RNA作为模板,进行RT-PCR,克隆得到全长/^XLIS基因,该基因开放阅读框架长1779bp,其编码的蛋白序列长592个氨基酸,,。在pET_32a原核表达载体中插入克隆得到的/^ALIS基因,并且转入到表达菌株中,诱导表达重组LIS蛋白。进行香雪兰重组LIS蛋白的体外酶活反应,气相色谱与质谱联用(GC-MS)检测反应产物,结果显示反应产物中有沉香醇的生成,说明原核表达制备的LIS蛋白有沉香醇合酶的活性,证明克隆得到的基因是沉香醇合酶基因。有益效果:沉香醇具有广阔的市场价值,被广泛应用于香料合成、食品添加剂、医药等领域。香雪兰沉香醇合酶cDNA的特征如下:其中1:香雪兰沉香醇合酶基因中间核苷酸序列()GACTACATGCAG香雪兰沉香醇合酶基因中间核苷酸序列长为109bp。其中2=RACE法获得香雪兰沉香醇合酶基因的3’端序列()TTGGATGAACTAGAACTCTTTACTGATGCTGTCAACAGATGGGATTCTAA香雪兰沉香醇合酶基因的3’端序列长为744bp。其中3:香雪兰沉香醇合酶基因的5’端序列()TCTTAAAGGAGTTCAAAGCTCTAACTATCGTTTTCGCTGTTGTATCAACACTGGAACTTCACAGAACATATGGGATGATAGCTACATTCAAGCACTCAATTGTGGCTACATGGGTGATGAACAGGTCAATGAAATTAGGAAGTTAAAGGAGGACGTGAGGCAACTATTTAGTGACTCGAAAGAGATTTTGTATCAAATTGAGCTCATTGATGAGCTGCAGCAGCTTGGGGTGGCATATCACTTTCAGGATGAGATATATTTTGCTCACTAGAGAAGACAAGCTTATTTATGGACAATGATCTTAAGGCAACATTCAGCAGATATATTCAACAACTTCATAGAAAACAAAATGGAAGGAGAAAATCAACTGGATGAGGCTAGGGTGTTTGCAACTGAACATCTAAGACAATTGTCGGAGTCATTAGTAGAGGAAGCTAGATTTCAACTTTGTAATCTGGGTCTTGGACAAAAGCTGAGCTGAAACTATCGCAAAATAGGTTGGATGAACTAGATTATATGAAGATATGCTACAACTAAGGAGATCGTGGGCAG香雪兰沉香醇合酶基因的5’端序列长为1246bp。其中4:香雪兰沉香醇合酶基因的全长核苷酸序列()TCTTAAAGGAGTTCAAAGCTCTAACTATCGTTTTCGCTGTTGTATCAACACTGGAACTTCACAGAACATATGGGATGATAGCTACATTCAAGCACTCAATTGTGGCTACATGGGTGATGAACAGGTCAATGAAATTAGGAAGTTAAAGGAGGAAGTGGGGCAACTATTTAGTGACTCGAAAGAGATTCTGTATCAAATTGAGCTCATTGATGAGCTGCAGCAGCTTGGGGTGGCATATCACTTTCAGGATGAGATATATTTTGCTCACTAGAGAAGACAAGCTTATTTATGGAGAATGATCTTAAGGCAACATTCAGCAGATATATTCAACAACTTCAGAGAAAACAAATAAAGAATGATATGGAAGGCATGATAAACTTGTATGAAGCTTCATTTTTTGCGGTGGAAGGAGAAAATCAACTGGATGAGGCTAGGGTGTTTGCAACTGAACATCTAAGACATCTGTCAGAGTCATTAGTGGAGGACTACATTTTAGGATGTCGAGGTTGCATACTCGTTGGAAGCTAGATTTCAACTTTGTAATTTGGGTCTTGGACAAAAACTGAGCTGAAACTATGGCAAAATAGGTTGGATGAACTAGATTATATGAAGACATGCAACAATACTGTGGTACTAACTCAGGCTTACTGTACAAGTGATGATTTCTCGGAAAATCAATTCAATGCTACATGCAATTTCAAAGAAGTTCGATTATAGAATGTCACAATGCTCTAA克隆得到FhLIS基因全长为1779bp,下划线表示的是该序列的起始密码子和终止密码子。其中5:由PALIS基因核苷酸序列推测得到的蛋白质序列()INTGTSVSQPLRRAASYPQNIWDDSYIQALNCGYMGDEQVNEIRKLKEEVGQLFSDSKEILYQIELIDELQQLGVAYHFQDEIKDKLSTIFCSLEKTSLFMENDLKATSLVFRLLREHGFHASADIFNNFRENKGNFKSCLKNDMEGMINLYEASFFAVEGENQLDEARVFATEHLRHLSESLVEASLRERVAHALELPLHFRMSRLHTRWFIDWYEKKVDKNSNLCRLAKLDFNFVQNIYKRELKELSRffffTNLGLGQKLSFARDRLVENYLFVIGWAFEPKLWQNREAMTMANCLVTTLDDIYDVYGSLDELELFTDAVNRffDAEAIEQLPDYMKTCIMALFNTTNLTANKIMYSKGVNIIPQLRRSWADLCKAYLVEAKffYHSGYMPTLEEYLDTAWISISGPVVLTQAYCTSENITDEALKCYNFYPDVVRQSSMISRLffNDLATSTAEMERGDVPKSIQCYMHEKGVSEEVAREHIRDMIVSISKKFDYDCISNSSIAESLKSVALDVHRMSQCVYQYEDGYGEQGHQKREQVISLLFEPIPL-香雪兰沉香醇合酶基因编码的蛋白序列长592个氨基酸,,。图1为^LIS基因的全长RT-PCR电泳图;其中1:DL2000111&151';2-5:退火温度分别为511:、541:、561:、591:时?0的产物,/7ALIS的位置如箭头所示;图2为/^ALIS基因原核表达载体构建的PCR验证电泳图3为AALIS基因原核表达载体构建的酶切鉴定电泳其中I:DL5000maker;2:重组质粒酶切;3:pET_32a(+)质粒图4为沉香醇标准品的GC-MS检测结果图,();图5为/^ALIS重组蛋白体外酶活反应产物的GC-MS检测结果图,();图6为对照反应的GC-MS检测结果图,在保留时间