非小细胞肺癌预后检测组合物及其应用的制作方法.docx

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。对照组miR-27a含量在72h含量升高,与其他各时间段比较,差异均有显著性(P均〈)。DDP()组miR-27a含量在12h、24h、48h和72h逐渐升高,两两比较差异均有显著性(P均〈)(图7)。[0062]SPC-Al细胞内miR-27a含量:DDP()组miR_27a含量在12h、24h、48h和72h均显著高于对照组,差异有显著性(P均〈)(图8)。对照组miR-27a含量在12h、24h、48h和72h均无显著变化,两两比较差异无统计学意义(P均>)。)组miR-27a含量在24h、48h和72h均显著高于12h,差异有显著性(P均〈);但24h、48h和72h含量无显著变化,两两比较差异无统计学意义(P均>)(图9)。[0063]miR-27a在DDP诱导的SPC-Al细胞凋亡中表达升高,提示其参与肺腺癌细胞凋亡调控。[0064]实施例3[0065]研究对象:26名晚期肺癌患者来自2010年3月至2012年5月南京医科大学第一附属医院科,男16名,女10名,年龄31~77岁(中位年龄:61岁)。均为初诊肺腺癌患者,无法进行根治性手术,未经放、化疗等治疗。肺癌的诊断均经组织病理学检查证实。患者接受一线或二线药物化疗,一线药物化疗方案多西他赛加顺钼,二线化疗药物为培美曲塞。患者中有7位完成3~4周期的一线药物化疗,其余15位完成I~2个周期的短期化疗。每个化疗周期结束后参考RECIST标准进行一次疗效评价,患者随访至2013年3月。[0066]化疗疗效评判每个化疗周期根据影像学检查结果,依据RECIST标准进行一次。具体标准如下:完全缓解(CR):所有非目标病灶消失和肿瘤标志物水平正常;部分缓解(PR):基线病灶长径总和缩小>30%;病情进展(PD):基线病灶长径总和增加>20%、绝对值增大5mm或出现新病灶;病情稳定(SD):基线病灶长径总和有缩小但未达PR或有增加但未达H),一个或多个非目标病灶和/或肿瘤标志物高于正常持续存在。本研究中,一线药物化疗后,采取患者最好化疗效果确定其疗效分组。[0067]样本采集与处理:接受3~4周期化疗的7位患者分别于化疗前I~7d及每次化疗周期用药结束后I~2d采集静脉血。旨在监测短期血清miR-27a水平变化的19位患者于首次化疗前I~7d及首个化疗用药后I~2d采集静脉血。使用分离胶促凝管采集患者肘部静脉血2mL,3000rpm/min离心5分钟,分离上层血清,再于4°C16000g离心IOmin,分装上层血清每管200μI于样本保存管中,涡旋混匀后置_70°C保存待测。上述操作于样本采集后2小时内完成。QIAzoI试剂法提取血清RNA。[0068]miR_27a逆转录反应:使用2720型基因扩增仪在同一反应管中同时逆转录目的基因miR-27a和参比基因cel-miR-39。每个反应体系包括miR_27a5Xprimer(ABIassayID001582);cel-miR-395Xprimer(ABIassayID000408);IOOmmol/;50U/μLreverseTransonpraselμL;;;;总体系15μL。逆转录反应条件同实施例2。[0069]双重荧光定量PCR检测miR_27a相对含量:使用ABI7500荧光定量PCR扩增仪在不同反应管中同时扩增目的基因miR-27a和参比基因cel_miR-39。每个反应体系包括miR-27a20X引物(ABIassayID001582带荧光探针);cel-miR-3920Xprimer(ABIassayID000408);2Xmix5μL;