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青霉素酰化酶的凝胶团聚体状稳定生物催化剂及其制备方法.docx


文档分类:高等教育 | 页数:约24页 举报非法文档有奖
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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。青霉素酰化酶的凝胶团聚体状稳定生物催化剂及其制备方法专利名称:青霉素酰化酶的凝胶团聚体状稳定生物催化剂及其制备方法技术领域:本发明涉及一种稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂。本发明还涉及到使用一种简易固化同时结合沉淀、交联及包埋的方法来制备生物催化剂,这种方法易于实现扩大再生产,其中固化过程中使用的是无毒材料。背景技术:酶如果溶于水或水与其他共溶剂的混合液中,只能是单次使用的转化循环。为了克服这个缺点,出现了固化技术。作为催化剂的酶在工业生产过程中使用越来越多,导致对酶的固化形式产生的需求在不断增加。经常被称之为“生物催化剂”的固化酶被广泛用于工业有机合成和生物转化。据2002年的调查,目前有130多个生物转化产业在大规模地使用生物催化剂,主要集中在医药中间体和其它精细化学品的生产中。多年来广为接受的固化技术,有着显著地变化和改进。今天,固化是针对特定用途及用于像加工固化抗体、大分子复合物和结构蛋白质为目的而进行的,但是固化酶(生物催化剂)起着巨大的作用。生物催化剂是采用全活的或全死的细胞或其制得的酶来生产的。酶的来源可以是不同植物和动物以及微生物。酶的生产规模集中扩大以及蛋白质工程的研究进展使得有可能生产出商业规模经济可行的生物催化剂。酶的反应特别高效,它是基于酶的特定条件,例如特定的培养基、活性、对应选择性、生产力、稳定性、最适PH和最适温度等等。缺乏作用稳定性以及相对较高的价格阻碍了大量酶的商业化。如果能找到一个有效的固化方法,这个障碍是可以克服的。如果能够成功,这将不仅可以提高选择性和作用稳定性,而且可以简易地分离,使酶可以重复利用并简化下游加工。因此选择合适的固化方法来生产合适的生物催化剂变得至关重要。从概念上讲,固化有几种方法。其中包括吸附、载体捆绑、诱导和交联。物理吸附依赖于酶和载体的亲和力。虽然简单,但是吸附作用微弱,酶可随时解吸和失去。载体捆绑涉及通过离子或共价键连接酶和水的不溶物。这个过程有一个缺点,因为强的化学键会使酶分子部分失活。另外,目标酶需要更加纯化,最终会提高催化剂的生产成本。第三种固化方法涉及在凝胶或由适当的有机或无机天然物或合成聚合物制成的微胶囊中进行确定酶的诱导。这种方法的优点是由于改变了强共价键,因此不会使蛋白质的失活。所选择凝胶基质或纤维形成的孔隙大小可适当调整,以容纳超高分子量的酶分子。然而,通过选择性地允许小反应物分子的通过,从而排除了从载体中分离酶的其他可能。更多的时候,诱导方法是与交联方法在一个数量配置下相结合,特异性的双功能剂如戊二醛与蛋白质构成的大聚合物形成了分子共价键。交联还使包埋酶具有一定强度和物理力量;此外,支持物通常似乎用于与整个细胞的相容包埋,所用的酶与那些用于共价捆绑的相比具有低特异性和低纯度。这基本上使这个方法更符合成本效益。大量的文献表明可以用不同的材料和产品来形成固化酶。一篇名为“利用基质孔隙与戊二醛交联从粪产碱菌中固化出药用的全细胞青霉素G酰化酶”,程世伟等人,(生物技术通讯,2006年7月,28卷(14):1129_1133)%(w/v)CTAB时,。处理后的细胞被聚乙烯醇与硼酸的交联体包埋,并与2%(ν/ν)戊二醛交联以增加稳定性。在固化系统的大量反应中,青霉素G转化为6-氨基青霉烷酸的转化率为75%。15个循环后活性没有降低,并且65%的酶活性保留到第31个循环时结束。美国专利号为4727030和4978619的专利也公开了凝胶基质用于酶或细胞的固化近来,交联酶聚集体(CLEAs)作为固化酶,具有越来越重要的作用,并视为利用聚合体进行固化的有利选择。但是,它的工业生产可行性需要进一步的评估,因为大多数酶的CLEA粒子太小,会引起严重的过滤问题。虽然,CLEA具有高酶活的明显优点,但是这种操作引起的过滤问题阻碍了商业上的开发。重要的工作已经在这一特定领域报道并公开,但是只有少数技术已成功地用于商业水平。来源于微生物的青霉素酰化酶通常以固化形式应用于内酰***抗生素的中间体合成。文献报导,全细胞青霉素酰化酶催化剂,酶的固化通过包埋或共价交联纯化酶的形式,包括基于交联酶晶体(CLEC)和交联酶聚集体CLEA的催化剂。青霉素酰化酶的固化通过二甲苯二***与戊二醛(Poly-XDA-GA-PA)的交联,团聚体(r)7500包埋在凝胶和壳聚糖中,PGA-450FERMASEPA250,全细胞与聚乙烯亚***交联,仅举几例。美国专利号为5846762的权利要求利用含丙二醇的凝胶和含戊二醛的藻酸盐来形成含有不同酶的包埋酶的凝胶珠。美国专利号为6060268的权利要求制备固化青霉素G酰化酶,通过与交联凝胶体和其他诸如海藻酸***、壳聚糖或聚乙烯亚***的聚合物的交联共价连接。通过任何方式固化的酶已经出现,一个理想的工业固化酶需要符合若干标准,例如可回收性、广泛适用性、成本效益、环境和安全问题。此外,固化的工业规模条件更加严格,因为由于使用了多官能团的反应物,导致细胞或酶失活。此外,固化生物材料较低的物理力量会阻碍孔隙的扩散极限,从而限制了催化剂的长时间使用。因此,固化酶的失活处理也应该占据工业规模。这一点在某些酶的情况中尤其明显,像固化青霉素酰化酶成吨用于生产半合成内酰***抗生素,在中间体和最后药物分子的制备中都有用到。因此,需要开发一种高活性和作用稳定性的生物催化剂,在水解和催化合成中具有多种用途,即在半合成内酰***抗生素的生物转化领域,而本发明已经实现。发明内容如上文所述,本发明公开了一种稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂及其固化方法。所述的固化方法的原理是沉淀部分纯化酶,同时使用如戊二醛等交联剂进行团聚,并包埋到如凝胶等天然聚合物和如聚乙烯醇等合成聚合物的混合物中,然后在温和的温度和ρΗ中进行有效的凝胶化,获得一种稳定的生物催化剂。因此所获得的这种稳定的生物催化剂是一种有效的固化产物,其中酶是留存于凝胶基质中,而不会分散开来。所述的凝胶材料形成一种稳定的基质,该基质不仅能抗机械压力,防止酶活降低,还能增加酶反应物的转化总量,因此可以降低浓度梯度的最低值。(pKA18)分泌的、具有高效水解活性的青霉素酰化酶,(pKXIPl)(pKXIPl)分泌的、具有高效合成活性的新青霉素酰化酶,它能制备固化的、稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂。本发明的一个选择性的方面是也可以使用全细胞。也可以使用相似的方法来固化其它的酶,如脂肪酶、蛋白酶、醛缩酶、异构酶等。本发明的另一个方面是使用在低温下被硫酸铵充分沉淀后纯化的部分酶,其中硫酸铵的浓度优选适用于每种酶,该浓度范围为20-50克/克蛋白质。然后沉淀形成的酶与如戊二醛(GA)等双官能剂交联,形成稳定的团聚体。这种颗粒阶段含有非特定蛋白质,它可以辅助交联,增加所形成的团聚体尺寸,使团聚体反复留存在包埋中不发生分散。缩写词6-APA6-去乙酰氧基头孢烷酸7-ADCA7_去乙酰氧基头孢烷酸PAA:***:重量比w/v重量比体积ν/ν:体积比W:重量HPGMe:D-p-羟基苯甘氨酸甲酯PVA:聚乙烯醇GA戊二醛U活性单位活性的定义是指在单位时间里,标准条件下,为每种酶催化1微摩尔底物或催化生成1微摩尔产物的量。图1所示的是固化催化剂的稳定性(蓝线例1,例如:(pKA18)分泌的酶沉淀,粉红线例2,)。图2所示的是蛋白质浸析程度(蓝线例1,例如:(pKA18)分泌的酶沉淀,粉红线例2,)。图3所示的是生物催化剂的青霉素***解活性曲线。图4所示的是反应温度对生物催化剂的青霉素***解活性产生的影响。图5所示的是重复了30个转化循环的阿莫西林的酶合成。图6所示的是重复了50个转化循环的阿莫西林的酶合成。图7所示的是含有不同酯类的阿莫西林实例。具体实施例方式下面将结合优选和选择性的实施例详细描述本发明,通过各种改变来辅助读者更充分地理解评估本发明。因此本发明包括在低温下通过盐析天然蛋白质溶液,形成部分可溶性沉淀,在交联剂的辅助作用下进一步交联形成团聚体,从而获得沉淀团聚的酶。在一个优选的实施例中,本发明提供了一种稳定实用、高效且作用稳定的生物催化剂,其制备方法包括以下步骤(a)在1°C_2°C的温度下,沉淀同时交联含有硫酸铵和戊二醛的酶液,获得交联的酶团聚体;(b)使交联了硫酸铵和戊二醛的酶在18至23摄氏度,优选20至21摄氏度的高温下进行转化而自己产生固化交联的酶团聚体;(c)在低温下,将所述的团聚酶于10%w/w的聚乙烯醇和10%w/w的凝胶混合溶液中包埋;(d)然后在5°C的低温下继续凝胶化12个小时;(e)过150微米筛,得到凝胶酶,于是获得均勻分布的凝胶团聚体;(f)将戊二醛与凝胶团聚体在30°C,-,以提高结构的稳定性。在优选的实施例中,(pKA18)分泌的、具有高效水解活性的青霉素酰化酶,(pKXIPl)(pKXIPl)分泌的、具有高效合成活性的新青霉素酰化酶。使用的沉淀剂主要是无机盐或生物聚合物或它们的溶液或混合物。其中是根据沉淀的酶来进行选择的,并且沉淀不能对酶的活性和稳定性产生负面影响。一些公知且传统使用的沉淀物包括季铵盐和聚乙二醇及其溶液,如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、***和叔丁醇。可以使用多***,但这些都是公知的能与交联过程发生反应,因此优选使用硫酸铵。硫酸铵的使用量一般高于其水饱和浓度。据文献报道,百分率范围为10-80%。但是,它必须用于特定的酶及相关过程。因此,在本实施例中,硫酸铵的浓度是根据酶液的蛋白质浓度确定的。优选的浓度是20-30克/克蛋白质。因此,饱和浓度范围为50-70%。优选在0-5°C,更优选1_2°C的低温下进行沉淀,形成凝胶团聚体。使pH7-,开始产生沉淀,5°C下继续12小时后使团聚更充分。离心,分离出沉淀。酶分子数和它们在团聚物中的存在方式会明显影响酶活性。在团聚的过程中会降低酶的溶解度。这时,酶会发生变性,于是就能优化确定过程中的团聚时间和温度。1_2°C下,在缓冲液中进行5分钟交联,同时加入交联剂加速交联。、-,它用于优化酶。可以在一个实施例中选择上述方法中所述的交联时间、温度和戊二醛添加物来形成一种不溶的沉淀,即交联后的酶团聚物(CLEA)。尽管有各种公知的交联剂,但是戊二醛是一种低廉且功能最多的试剂。已经研究出适于每种酶的浓度范围。如果是青霉素酰化酶,%-%。-%。如果是新青霉素酰化酶,那么选择相似,-%。本发明的优选实施例中使用了各种用于包埋过程的载体材料。可以使用有机物和无机物,天然的或合成的、丙烯酰***、壳聚糖、海藻酸钠、聚乙烯醇、凝胶。在合适的浓度中,两种或两种以上的材料混合的混合物形成稳定的固化生物催化剂。最合适的载体还可以选择性地用于产品开发。各种材料通常可以用于不同过程和酶的包埋。通常优选的材料是如丙烯酰***的合成物或如海藻酸钙、角叉菜胶、凝胶等天然物。选择那些能影响过程的因素。虽然如丙烯酰***的单体能相对形成无活性的聚合物,该产物可能含有未聚合的单体残留物,这可能会对操作者带来危险,还需要处理问题。此外,聚合引发剂二甲氨基丙***是剧毒,必须非常小心处理。温和条件下,在褐藻钙凝胶中形成包埋获得固化,该包埋广泛地用于全细胞的固化。然而因为这些系统存在作用稳定性和酶浸析效果的内在问题,所以其提高的可能性较小。除了丙烯酰***、壳聚糖、海藻酸钙;凝胶也具有良好的潜在凝化性能。凝胶是一种动物蛋白,往往会在某些温度的溶液中形成凝胶。根据所使用的凝胶黏度和凝胶强度,凝胶可以与其他高分子材料混合来提高其强度。通过优化凝胶的浓度,并使用其它聚合物,可以控制这种凝胶的孔径。此外PVA与酶的水溶液混合物在低温下形成一种脱水凝胶,其中凝胶可以模制成需要的形状。然而,加入任何其他高分子材料还可以增加保水性和机械强度,但需要优化。由于丙烯酰***一直被用作聚合剂,并且它使用时添加了(PVA)和凝胶;但其产物的产量比没有使用含凝胶和聚乙烯醇的丙烯酰***更低。其中一个原因就是聚合的不充分,这可以从所形成的非常软的材料明显看出。这可能会导致酶从固化酶中滤去,使产量降低。虽然可能会改善交联和聚合,但是通常会选择不使用危险材料,如丙烯酰***。因此就无法进行进一步的操作。当用壳聚糖代替PVA时会使终产物的稳定性较低。据报道,壳聚糖与凝胶混合用于固化(团聚),但是凝胶和壳聚糖的浓度需要进一步优化,以增加终产物的量。为了克服上述的缺点,本发明使用了聚乙烯醇,它与凝胶一起作为聚合体用于青霉素酰化酶的固化,它与丙烯酰***、海藻酸钙或壳聚糖相比能形成更好的包埋聚合体。本发明所使用的聚乙烯醇,其分子量为125000,粘度为35_50cs。所使用的凝胶为药用凝胶。优选使用分子量超过100000的高分子量PVA。商用PVA具有幅度较广的分子量分布,其分散度指数的范围为2到5。分子量会影响很多性能,如粘度、可结晶性、机械强度和扩散性。PVA的分子量与聚合度直接成正比。聚合度会影响PVA在水中的溶解度。具有高聚合度和水解能力的PVA,其分子量超过77000,其中疏水的醋酸基削弱了其相邻羟基的内分子氢键。因此,当温度升高70°C以上,就会发生分散。它在加入到酶中之前必须冷却。药用的PVA可与如戊二醛等通常不溶于水的试剂进行交联。PVA可以形成水凝胶,

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