中药含药血清药理研究方法精讲.pdf

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丸含药血清进行体外实验和用血府逐瘀丸进行临床治疗前后相关指标观察,二者在抑制血小板粘附聚集性及增加红细胞变形性方面的作用基本一致,也即用含药血清进行体外实验所反映的结果基本和临床疗效相吻合。(一)采血时间的确定药物灌胃给动物后,血药浓度呈现由低到高、由高到低的时量过程,何时采血,是含药血清制备技术中至关重要的一步,直接影响药效的呈现。采血时间过早过晚,不仅不能很好的反映药效,而且也与方便实验操作有关。因此,通过实验摸索出一个较为准确而易行的采血时间是含药血清制备技术中的重要一环。经典方法建议,方剂给药后可设定4-5个时间点采血,观察药效的时效过程,选择药效峰值时作为以后实验的采血时间。另一方面,许多研究显示,虽然不同方剂-.--:..--之间;各实验中,给药后1-2小时采集的含药血清均反应出药效。也可以连续5个半衰期给药达到稳态血药浓度后采血。(二)口饲给药剂量的确定实验显示,--2小时所采集的含药血清,在体外进行相应实验,能呈现药理作用。或者遵照新药药效学试验动物给药剂量计算方法确定给药剂量。含药血清的剂量表述也是一个值得探讨的问题,这里涉及血清供体动物的口饲给药量以及体外试验时的含药血清稀释后终浓度量。为了更确切的表示剂量,在叙述结果时,应说明供体动物的口饲给药剂量以及体外试验时含药血清的终浓度或稀释倍数,并以g生药/kg体重/U表示剂量(如以含桂枝汤的大鼠血清对HSV-1病毒的作用实验为例:动物口饲给药量为10g生药/kg体重,实验时所用含药血清的终浓度为1:12稀释,则含药血清的剂量为10/12=,这里U表示是血清在体外系统中终浓度时的稀释倍数。(三)给药次数、给药天数对药效的影响重复给药是临床常用的治疗方法,给药次数、给药天数与含药血清的药效有关。确定一个有效而又简单易行的给药方案,有利于血清药理学的推广和应用。研究显示,同一剂量一次给药优于分次给药,同一剂量多次给药优于单次给药,多日给药优于一日给药。分析比较多项实验结果,参照中医临床用药****惯,现代药理学中关于血药浓度和现有药动学中半衰期数值的实际,为了方便多次给药后含药血清的-.--:..--可每日给药二次,连续二天,第三天上午给药后小时采血,以便获得药效作用强的含药血清。(四)采血部位对含药血清药效的影响选择适当的采血部位是为了最大限度、最方便地获得含药血清,从一些对比实验看,分别从动脉、静脉采血对药效似无明显影响。如果药效物质利用、代速度快的从动静脉中采集的血清,在药效上可能会有所差异,由此,能否给我们对药物作用维持时间的认识有所启示。另外,从门静脉和肝静脉分别采集含药血清,比较他们的活性,能否也可给我们就肝脏对该药物代的影响有所启?这些是含药血清应用研究上应进一步进行的工作。(五)动物种属的差异性通过对大鼠、小鼠、兔、犬、豚鼠及正常人血清及含药血清对不同反应体系作用的结果显示,不同种属动物血清在不同实验体系寻求合适的血清添加量(指含药血清在反应体系中的终浓度)对正确判断实验结果是不可忽视的因素之一,应在预实验中予于探讨。一般来说,提供含药血清的动物种属与提供反应体系的动物种属越接近,血清的添加量越大。(六)供血的实验动物数采集含药血清所需动物数应遵循动物实验的一般原则,如大鼠、小鼠或豚鼠每组动物数应不少于10只,家兔应不少于8只,以避免动物个体差异所致不均匀性。可以一个动物一份血清,做个体含药血清药效测定,亦可将同组个体血清混合后作为一个样本使用。-.--:..--含药血清经低温保存后是否对药效产生影响与所观察的药效指标和药物本身有效成分的稳定性有关。如抗病毒实验,血清可在℃保存5天或-20℃保存二月,药效不受影响;在一些生化反应体系中,含药血清-20℃保存二月后,有的对药效无明显影响,有的对药效能产生明显影响,因此以采用新鲜血清为好。含药血清药理方法体外反应体系确定的规化技术(一)严格执行正常血清对照含药血清中除药物的成分、药物的代产物和药物引起的反应产物-.--:..--还有血清中固有的生物活性成分和其他的干扰因素,能对体外系统起作用。为排除干扰,应在实验时设正常血清对照组。正常血清可在给药前采集或另设一组动物采集,含药血清的作用强度,应与正常血清比较而确定。(二)反应体系中含药血清添加量(即反应体系中含药血清的终浓度)含药血清在体外实验系统中,一般常和反应液或培养液共同培育。由于种系不同,正常血清对反应对象(细胞、酶等)会产生程度不同的影响,就需要有合适的血清添加量。一般而言,在一定围含药血清的添加量与药效物质的含量成正比。与药效强度成正比。但达到足够添加量后,继续增加含药血清用量,或引起药效强度的降低或引起反应系统损伤。从现有研究结果可见,反应体系中含药血清终浓度一般在20%或以下较宜。增加口饲给药剂量后,含药血清的添加量应相应减少。(三)血清冻干技术的应用为了增加血清的添加量以更好的反映药效,可将含药血清制成冻干粉,使用时以维持液溶化。含药血清制成冻干粉后可显著增加反应体系中血清添加量。(四)含药血清的灭活正常血清中含有大量生物活性物质,它们在含药血清的反应体系是否产生干扰,血清经56℃30min灭活后是否可排除这些干扰,而-.--:..--清灭活后对药效的影响与选择的反应体系及正常血清是否含有相关的活性物质有关。在目前一些生化反应体系中,血清对药效似未产生显著影响。在细胞培养的抗病毒实验中,由于正常血清中含有补体等生物活性物质,可以较强干扰细胞和病毒的生长和繁殖,灭活后使这些作用下降约;含药血清中既有上述的生物活性物质又有药物的有效成分,灭活后排除了正常血清中的生物活性物质,虽然使药物作用强度下降,但可体现药物本身作用,因此,在体外进行抗病毒实验时应采用灭活血清。(五)预处理方法对血清活性的影响有些体外实验和分析研究中需要去除血清中的蛋白,但血液中的药物成分一部分是与血浆蛋白结合而存在,去蛋白的不同预处理后对药效产生何种影响值得关注。以抗Ach收缩支气管平滑肌为例,可见正常血清经乙醇、***、甲壳素处理去蛋白后,显著降低其作用,而56℃30分钟使蛋白变性则无明显影响。也有研究发现,含小青龙汤血清经***处理后对支气管平滑肌抗His和Ach的抑制无明显影响。血清去蛋白后,对特定的生理生化、效能指标产生不同的影响,其重要因素是这些生物活性物质和药效物质同血清蛋白的结合能力。我们似乎有可能用含药血清去蛋白前后药效的变化,来估算有效成分不单一、不清楚的中药复方药效成分的蛋白结合率。-.--:..--,中药复方含有多种有效成分,用通常的检-.--:..--数,多个成分之间还会发生相互影响。用含药血清研究他们对药效的经时变化,有可能对我们了解中药复方作用的动力学过程,指导临床给药方案,了解中药复方的作用特点有所裨益。通过当归补血汤和大川芎丸含药血清对不同药效的动力学研究过程可发现,同一复方不同药效间的效应消除半衰期数值比较接近,效应达峰时间彼此间有相当差异。已知消除半衰期是动力学参数中重要的数值,对制定给药方案有很大影响,是否有可能通过对该方某一药效的效应半衰期的估测,大体可作为确定给药方案的参考;达峰时间的差异,如与血清药物化学相结合,能否作为研究确定不同药效活性成分的参考,也是以后值得研究的容。此外,目前在中药复方药物动力学研究中,还常采用以整体动物药理效应为测试指标的药理效应法和以整体动物毒理效应为测试指标的药物累积法。但以中药血清药理方法研究中药复方药物动力学有以下特点:由于采用体外实验方法,可以进行大量的药理效应试验观察,较整体动物易于控制。,分离出的含药血清可以进行多项药理效应试验指标观察,求出多个药理效应的药动学参数。,可以分析它与哪一项药理效应指标有关联。需要注意的是,在时间─效应实验中所用剂量过小或过大,可能会干扰药动学参数的测定,加之药理效应法较血药浓度法测定误差大,建议采用3~5种有效剂量(其中一种相当于临床等效剂量)平行地进行时效测定与比较。二中药血清药化学研究-.--:..--80年代末由日本学者田代真一同时提出的,但发展速度较后者缓慢。除可见沿用传统经典的血药浓度测定外,尚无独具特征的研究新方法和思路。有人提出以构建血清指纹图方法来开展研究,但相关具体研究报道较少。由于含药血清中的化学成分与含药血清的药理效应密切相关,因而中药血清药化学与中药血清药理协同研究,可能有助于研究的开展和深入。采用建立血清指纹图方法开展中药血清药化学研究,选择受试药物川芎中一个明确的单体成分阿酸为指标,以此为条件建立相应的血清指纹图。试验结果显示,川芎各提取物含药血清阿酸指纹图的分离度均较川芎生药粉好,提示在组分水平建立或开展中药血清药化学研究较为理想。在建立血清指纹图并测定相应含药血清药理效应强度后,应怎样进行分析研究,目前还没有具体的思路和方法报道。有设想提出下列推论方法和思路:含药血清的药理效应强度时相过程与其血清指纹图中该成分指纹峰大小的时相一致,说明该成分与该药理作用密切相关;含药血清的药理效应强度与其血清指纹图中该成分指纹峰的大小、有无不相一致,说明该成分与该药理作用不相关或不是该药理作用的主要成分。中药有很多成分不明确,或已知成分含量极少,又应怎样开展中药血清药化学研究,或与中药血清药理作用协同研究,这是一个值得探索的问题。三中药复方组合化学研究-.--:..--(CombinatorialChemicalResearchRTCP),是以中药复方为天然组合化学库(binatorialChemicalLibraries,NCCL),具有多靶作用机理(MechanismofMultitarget)特征为依据,在中医药理论的指导下确定能反映该方剂主治病证的病理生理和治则的药理学指标,通过组分或单体成分的组合筛选,找出其活性最强的组分构件,即确定方剂“有用分子(usefulmolecules)”的构成。中药复方组合化学研究与现代药学的组合化学研究不同之处,在于中医方剂本身就具有分子多样性特点,但这种多样性的特征是“有用的分子”不明确,无用或诱发毒副作用的分子占绝大多数(>80%)。因此,我们借鉴他们的思路,开展中药复方的组合化学研究,则是简化方剂的分子多样性,从而开发“有用的分子”组合的精简方剂。这是一种既体现整体观,又强调辩证分析的方法。中药复方组合化学研究亦不同于现在普遍采用的直接测定成分法,而是一种排出筛选法,充分体现复方多组分协同的特点,具有很强的操作性──简便、快速、高效。在研究中,采用中药血清药理方法,具有一些优点,如可以开展细胞药理学和分子药理学的体外筛选方式,可以进行大批量的多项药理指标筛选,其结果能真实的反映中药复方在体的血药浓度。-.--