生物大分子制备.docx

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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。生物大分子制备生物大分子制备1/34生物大分子制备生物大分子的制备归纳生物大分子主若是指蛋白质、酶(也是一种蛋白质)和核酸,这三类物质是生命活动的物质基础。在自然科学,特别是生命科学高度发展的今天,蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是研究生命神奇的中心课题,而生物大分子结构与功能的研究,必定第一解决生物大分子的制备问题,没有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题,结构与功能的研究就无从谈起。但是生物大分子的分别纯化与制备是一件十分认真而困难的工作,有时制备一种高纯度的蛋白质、酶或核酸,要付出长远和艰辛的努力。与化学产品的分别制备对照较,生物大分子的制备有以下主要特点:⑴生物质料的组成极其复杂,经常包括有数百种以致几千种化合物。其中好多化合物到此刻仍是个谜,有待人们研究与开发。有的生物大分子在分别过程中还在不断的代谢,所以生物大分子的分别纯化方法差别极大,想找到一种合适各种生物大分子分别制备的标准方法是不能能的。⑵好多生物大分子在生物质料中的含量极微,只有万分之一、几十万分之一,甚至几百万分之一。分别纯化的步骤众多,流程又长,有的目的产物要经过十几步、几十步的操作才能达到所需纯度的要求。比方由脑垂体组织获取某些激素的释放因子,要用几吨甚至几十吨的生物质料,才能提取出几毫克的样品。⑶好多生物大分子一旦走开了生物体内的环境时就极易失活,所以分别过程中如何防范其失活,就是生物大分子提取制备最困难之处。过酸、过碱、高温、强烈的搅拌、强辐射及自己的自溶等都会使生物大分子变性而失活,所以分别纯化时必然要采用最合适的环境和条件。⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的,温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响,很难正确估计和判断,所以实验结果常有很大的经验成份,实验的重复性较差,个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。由于生物大分子的分别和制备是这样的复杂和困难,所以实验方法和流程的设计就必定尽可能多查文件,多参照先人所作的工作,吸取其经验和精华,研究中的失败和屡次是不能防范的,只有拥有不卑不亢的研究精神才能达到预期的目的。生物大分子的制备平时可按以下步骤进行:①确定要制备的生物大分子的目的和要求,是进行科研、开发仍是要发现新的物质。②建立相应的可靠的解析测定方法,这是制备生物大分子的要点,由于它是整个分别纯化过程的“眼睛”。③经过文件调研和预备性实验,掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。④生物质料的破碎和预办理。⑤分别纯化方案的选择和研究,这是最困难的过程。⑥生物大分子制备物的均一性(即纯度)的判断,要求达到一维电泳一条带,二维电泳一个点,或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。⑦产物的浓缩,干燥和保留。解析测定的方法主要有两类:即生物学和物理、化学的测定方法。生物学的测定法主要有酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等;物理、化学方法主要有比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法(紫外/可见、红外和荧光均分光光度法)、电泳法、以及核磁共振等。实质操作中尽可能多用仪器解析方法,以使解析测定更加迅速、简略。生物大分子制备物的均一性(即纯度)的判断,平时只采用一种方法是不够的,必定同时采用2~3种不同样的纯度判断法才能确定。蛋白质和酶制成品纯度的判断最常用的方法是:SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳和等电聚焦电泳,如能再用高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)进行结合判断章更加理想,必要时再做N-尾端氨基酸残基的解析判断,过去曾用的溶解度法和高速离心沉降法,现已很少再用。核酸的纯度判断平时采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰***凝胶电泳,但最方便的仍是紫外吸取法,(A260和A280),从A260/A280的比值即可判断核酸样品的纯度。要认识的生物大分子的物理、化学性质主要有:①在水和各种有机溶剂中的溶解性。②在不同样温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的牢固性。③固态时对温度、含水量和冻干时的牢固性。④各种物理性质:如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等。⑤其他化学性质:如对各种蛋白酶、水解酶的牢固性和对各种化学试剂的牢固性。⑥对其他生物分子的特别亲和力等。制备生物大分子的分别纯化方法多种多样,主若是利用它们之间特异性的差别,如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。各种方法的基本源理基本上能够归纳为两个方面:一是利用混杂物中几个组分分配系数的差别,把它们分配到两个或几个相中,如盐析、有机溶剂积淀、层析和结晶等;二是将混杂物置于某一物相(大多数是液相)中,经过物理力场的作用,使各组分分配于不同样的地域,从而达到分其他目的,如电泳、离心、超滤等,目前纯化蛋白质等生物大分子的要点技术是电泳、层析和高速与超速离心。由于生物大分子不能够加热融化和汽化,所以所能分配的物相只限于固相和液相,在此两相之间交替进行分别纯化。在实质工作中经常要综合运用多种方法,才能制备出高纯度的生物大分子。纯化生物大分子总是希望纯度和产率都要高。比方纯化某种酶,理想的结果是比活力和总回收率都要高才好,但实质上两者不能够兼得,平时在科研上希望比活力尽可能的高,而牺牲一些回收率,在工业生产上则正相反。生物大分子制备的前办理生物质料的选择制备生物大分子,第一要选择合适的生物质料。资料的本源可是是动物、植物和微生物及其代谢产物。从工业生产角度选择资料,应选择含量高、本源丰富、制备工艺简单、成本低的原料,但经常这几方面的要求不能够同时具备,含量丰富但本源困难,或含量本源较理想,但资料的分别纯化方法繁琐,流程很长,反倒不如含量低些但易于获取纯品的资料,因此可知,必定依照详细情况,抓住主要矛盾决定弃取。从科研工作的角度选材,则只须考虑资料的选择吻合实验预定的目标要求即可。除此之外,选材还应注意植物的季节性、地理地址和生长环境等。选动物质料时要注意其年龄、性别、营养情况、遗传素质和生理状态等。动物在饥饿时,脂类和糖类含量相对减少,有利于生物大分子的提取分别。选微生物质料时要注意菌种的代数和培养基成分等之间的差别,比方在微生物的对数期,酶和核酸的含量较高,可获取较高的产量。资料选定后要尽可能保持新鲜,赶忙加工办理,动物组织要先除掉结缔组织、脂肪等非活性部分,绞碎后在合适的溶剂中提取,若是所要求的成分在细胞内,则要先破碎细胞。植物要先去壳、除脂。微生物质料要及时将菌体与发酵液分开。生物质料如暂不提取,应冰冻保留。动物质料则需深度冷冻保留。细胞的破碎生物大分子制备生物大分子制备2/34生物大分子制备除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶之外,关于细胞内或多细胞生物组织中的各种生物大分子的分别纯化,都需要起初将细胞和组织破碎,使生物大分子充分释放到溶液中,其实不扔掉生物活性。不同样的生物体或同一世物体的不同样部位的组织,其细胞破碎的难易不一,使用的方法也不同样,如动物脏器的细胞膜较纤弱,简单破碎,植物和微生物由于拥有较牢固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁,要采用特地的细胞破碎方法。机械法:研磨:将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中,加入少量石英砂研磨或匀浆,即可将动物细胞破碎,这类方法比较平和,合适实验室使用。工业生产中可用电磨研磨。细菌和植物组织细胞的破碎也可用此法。组织捣碎器:这是一种较强烈的破碎细胞的方法,平时可先用家用食品加工机将组织打碎,此后再用10000r/min~20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分别器)将组织的细胞打碎,为了防范发热和升温过高,平时是转10秒~20秒,停10秒~20秒,可屡次多次。(2)物理法:1)屡次冻融法:将待破碎的细胞冷至-15℃到-20℃,此后放于室温(或40℃)迅速融化,这样屡次冻融多次,由于细胞内形成冰粒使节余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。超声波办理法:此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时,时间要长一些,办理的收效与样品浓度和使用频率相关。使用时注意降温,防范过热。压迫法:这是一种平和的、完整破碎细胞的方法。在1000×105Pa~2000×105Pa的高压下使几十毫升的细胞悬液经过一个小孔突然释放至常压,细胞将完整破碎。这是一种较理想的破碎细胞的方法,但仪器花销较高。4)冷热交替法:从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右保持数分钟,马上放入冰浴中使之冷却,这样屡次多次,绝大多数细胞能够被破碎。化学与生物化学方法:自溶法:将新鲜的生物质料存放于必然的pH和合适的温度下,细胞结构在自己所拥有的各种水解酶(如蛋白酶和酯酶等)的作用下发生溶解,使细胞内含物释放出来,此法称为自溶法。使用时要特别小心操作,由于水解酶不但能够使细胞壁和膜破坏,同时也可能会把某些要提取的有效成分分解了。溶胀法:细胞膜为天然的半透膜,在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中,由于存在浸透压差,溶剂分子大量进入细胞,将细胞膜胀破释放出细胞内含物。酶解法:利用各种水解酶,如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等,于37℃,pH8,办理15分钟,能够专一性地将细胞壁分解,释放出细胞内含物,此法适用于多种微生物。比方从某些细菌细胞提取质粒DNA时,可采用溶菌酶(来自蛋清)破细胞壁,而在破酵母细胞时,常采用蜗牛酶(来自蜗牛),将酵母细胞悬于柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液(pH=)中,加1%蜗牛酶,在30℃办理30分钟,即可使大多数细胞壁破碎,%疏基乙醇收效会更好。此法能够与研磨法结合使用。有机溶剂办理法:利用***仿、甲苯、***等脂溶性溶剂或SDS(十二烷基硫酸钠)等表面活性剂办理细胞,可将细胞膜溶解,从而使细胞破碎,此法也能够与研磨法结合使用。生物大分子制备生物大分子制备3/34生物大分子制备生物大分子的提取“提取”是在分别纯化从前将经过预办理或破碎的细胞置于溶剂中,使被分其他生物大分子充分地释放到溶剂中,并尽可能保持原来的天然状态不扔掉生物活性的过程。这一过程是将目的产物与细胞中其他化合物和生物大分子分别,即由固相转入液相,或从细胞内的生理情况转入外界特定的溶液中。影响提取的因素主要有:目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小;由固相扩散到液相的难易;溶剂的pH值和提取时间等。一种物质在某一溶剂中溶解度的大小与该物质的分子结构及使用的溶剂的理化性质相关。一般地说,极性物质易溶于极性溶剂,非极性物质易溶于非极性溶剂;碱性物质易溶于酸性溶剂,酸性物质易溶于碱性溶剂;温度高升,溶解度加大,远离等电点的pH值,溶解度增加。提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。⑴水溶液提取:蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的牢固性好,溶解度大,是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是:盐浓度(即离子强度):离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响,有些物质,如DNA-蛋白复合物,在高离子强度下溶解度增加,而另一些物质,如RNA-蛋白复合物,在低离子强度下溶解度增加,在高离子强度下溶解度减小。绝大多数蛋白质和酶,在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度,如在纯水中加入少量中性盐,蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加,称为“盐溶”现象。但中性盐的浓度增加至一准时,蛋白质的溶解度又逐渐下降,直至积淀析出,称为“盐析”现象。盐溶现象的产生主若是少量离子的活动,减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力,增加了溶质和溶剂分子间互相作用力的结果。所以低盐溶液常用于大多数生化物质的提取。~/L~。不同样的蛋白质极性大小不同样,为了提高提取效率,有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低,增加离子强度(如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4)能够增加溶液的极性。pH值:蛋白质、酶与核酸的溶解度和牢固性与pH值相关。过酸、过碱均应尽量防范,一般控制在pH=6~8范围内,提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的牢固范围内,平时选择偏离等电点的两侧。碱性蛋白质选在偏酸一侧,酸性蛋白质选在偏碱的一侧,以增加蛋白质的溶解度,提高提取收效。比方胰蛋白酶为碱性蛋白质,常用稀酸提取,而肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质,则常用稀碱来提取。温度:为防范变性和降解,制备拥有活性的蛋白质和酶,提取时一般在0℃~5℃的低温操作。但少量对温度耐受力强的蛋白质和酶,可提高温度使杂蛋白变性,有利于提取和下一步的纯化。防范蛋白酶或核酸酶的降解作用:在提取蛋白质、酶和核酸时,经常受自己存在的蛋白酶或核酸酶的降解作用而以致实验的失败。为防范这一现象的发生,经常采用加入控制剂或调治提取液的pH、离子强度或极性等方法使这些水解酶失去活性,防范它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。比方在提取DNA时加入EDTA络合DNAase活化所必定的Mg++。搅拌与氧化:搅拌能促使被提取物的溶解,一般采用平和搅拌为宜,速度太快简单产生大量泡沫,增大了与空气的接触面,会引起酶等物质的变性失活。因生物大分子制备生物大分子制备4/34生物大分子制备为一般蛋白质都含有相当数量的巯基,有些巯基经常是活性部位的必要基团,若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键,以致酶活性的丧失。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防范巯基氧化。⑵有机溶剂提取一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链很多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中,常用不同样比率的有机溶剂提取。常用的有机溶剂有乙醇、***、异丙醇、正丁***等,这些溶剂能够与水互溶或部分互溶,同时拥有亲水性和亲脂性,其中正丁醇在0℃%,40℃%,同时又用拥有较强的亲脂性,所以常用来提取与脂结合较牢或含非极性侧链很多的蛋白质、酶和脂类。比方植物种子中的玉蜀黍蛋白、麸蛋白,常用70%~80%的乙醇提取,动物组织中一些线粒体及微粒上的酶常用丁醇提取。有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱,又能溶于含有必然比率的有机溶剂的水溶液中,在这类情况下,采用稀的有机溶液提取经常能够防范水解酶的破坏,并兼有除掉杂质提高纯化收效的作用。比方,胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液,但在组织中与其共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性,%~,进行提取,这样就从下面三个方面控制了糜蛋白酶的水解活性:①%的乙醇能够使糜蛋白酶暂时失活;②草酸能够除掉激活糜蛋白酶的Ca++;③采用~,是糜蛋白酶不宜作用的pH值。以上条件对胰岛素的溶解和牢固性都没有影响,却可除掉一部分在稀醇与稀酸中不溶解的杂蛋白。生物大分子的分别纯化由于生物体的组成成分是这样复杂,数千种以致上万种生物分子又处于同一系统中,所以不能能有一个合适于各种分子的固定的分别程序,但多数分别工作要点部分的基本手段是同样的。为了防范盲目性,节约实验研究时间,要认真参照和借鉴先人的经验,少走弯路。常用的分别纯化方法和技术有:积淀法(包括:盐析、有机溶剂积淀、选择性积淀等)、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、迅速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。本章以介绍积淀法为主。积淀法积淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。积淀法(即溶解度法)操作简略,成本廉价,不但用于实验室中,也用于某些生产目的的制备过程,是分别纯化生物大分子,特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。经过积淀,将目的生物大分子转入固相积淀或留在液相,而与杂质获取初步的分别。此方法的基本源理是依照不同样物质在溶剂中的溶解度不同样而达到分其他目的,不同样溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差别而引起的,溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构相关,溶剂组分的改变或加入某些积淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。在生物大分子制备中最常用的几种积淀方法是:⑴中性盐积淀(盐析法):多用于各种蛋白质和酶的分别纯化。⑵有机溶剂积淀:多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分别纯化。⑶选择性积淀(热变性积淀和酸碱变性积淀):多用于除掉某些不耐热的和在一生物大分子制备生物大分子制备5/34生物大分子制备定pH值下易变性的杂蛋白。⑷等电点积淀:用于氨基酸、蛋白质及其他***物质的积淀,但此法单独应用较少,多与其他方法结合使用。⑸有机聚合物积淀:是发展较快的一种新方法,主要使用PEG聚乙二醇Polyethyeneglycol)作为积淀剂。中性盐积淀(盐析法)在溶液中加入中性盐使生物大分子积淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶之外,多肽、多糖和核酸等都能够用盐析法进行积淀分别,20%~40%饱和度的硫酸铵能够使好多病毒积淀,43%饱和度的硫酸铵能够使DNA和rRNA积淀,而tRNA保留在上清。盐析法应用最广的仍是在蛋白质领域,已有八十多年的历史,其突出的优点是:①成本低,不需要特别昂贵的设备。②操作简单、安全。③对好多生物活性物质拥有牢固作用。⑴中性盐积淀蛋白质的基本源理蛋白质和酶均易溶于水,由于该分子的-COOH、-NH2和-OH都是亲水基团,这些基团与极性水分子互相作用形成水化层,包围于蛋白质分子周围形成1nm~100nm颗粒的亲水胶体,削弱了蛋白质分子之间的作用力,蛋白质分子表面极性基团越多,水化层越厚,蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大,所以溶解度也越大。亲水胶体在水中的牢固因素有两个:即电荷和水膜。由于中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性,所以加入大量中性盐后,夺走了水分子,破坏了水膜,裸露出疏水地域,同时又中和了电荷,破坏了亲水胶体,蛋白质分子即形成积淀。盐析表示图以下页“图2-1”所示。⑵中性盐的选择常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4,由于它与其他常用盐类对照有十分突出的优点:①溶解度大:特别是在低温时仍有相当高的溶解度,这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质平时是在低温下牢固,所以盐析操作也要求在低温下(0~4℃)进行。由下表能够看到,(NH4)2SO4在0℃%的溶解度,远远高于其他盐类:②分别收效好:有的提取液加入合适硫酸铵盐析,一步就可以除掉75%的杂蛋白,纯度提高了四倍。③不易引起变性,有牢固酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用2~3mol/L的(NH4)2SO4保留可达数年之久。④价格低价,废液不污染环境。⑶盐析的操作方法最常用的是固体硫酸铵加入法。欲从较大体积的粗提取液中积淀蛋白质时,经常使用固体硫酸铵,加入从前要先将其研成细粉不能够有块,要在搅拌下缓慢平均少很多次地加入,特别到凑近计划饱和度时,加盐的速度更要慢一些,尽量防范局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质积淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间,待积淀完满后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分别,高浓度硫酸铵常用过滤方法,由于高浓度硫酸铵密度太大,要使蛋白质完满沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示,称为百分饱和度,而不用实质的克数或克分子数,这是由于当固体硫酸铵加到水溶液中去时,会出现相当大的非线性体积变化,计算浓生物大分子制备生物大分子制备6/34生物大分子制备度相当麻烦,为了战胜这一困难,有人经过精心测量,确定出1升纯水提高到不同样浓度所需加入硫酸铵的量,附录中的实验数据以饱和浓度的百分数表示,使用时十分方便。⑷盐析曲线的制作若是要分别一种新的蛋白质和酶,没有文件数据能够借鉴,则应先确定积淀该物质的硫酸铵饱和度。详细操作方法以下:取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分别样品溶液,冷至0℃~5℃,调至该蛋白质牢固的pH值,分6~10次分别加入不同样量的硫酸铵,第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现积淀时,记下所加硫酸铵的量,这是盐析曲线的起点。连续加硫酸铵至溶液轻轻污浊时,静止一段时间,离心获取第一个积淀级分,此后取上清再加至污浊,离心获取第二个级分,这样连续可获取6~10个级分,依照每次加入硫酸铵的量,在附录中查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分积淀物分别溶解在必然体积的合适的pH缓冲液中,测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图,即可获取盐析曲线。⑸盐析的影响因素①蛋白质的浓度:中性盐积淀蛋白质时,溶液中蛋白质的实质浓度对分其他收效有较大的影响。平时高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其积淀下来,但若蛋白质浓度过高,则易产生各种蛋白质的共积淀作用,除杂蛋白的收效会明显下降。对低浓度的蛋白质,要使用更大的硫酸铵饱和度,但共积淀作用小,分别纯化收效较好,但回收率会降低。%~%,相当于25mg/mL~30mg/mL。②pH值对盐析的影响:蛋白质所带净电荷越多,它的溶解度就越大。改变pH值可改变蛋白质的带电性质,所以就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大,在等电点处溶解度小,所以用中性盐积淀蛋白质时,pH值常选在该蛋白质的等电点周边。③温度的影响:温度是影响溶解度的重要因素,关于多数无机盐和小分子有机物,温度高升溶解度加大,但关于蛋白质、酶和多肽等生物大分子,在高离子强度溶液中,温度高升,它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数仍是随浓度高升而增加的。在一般情况下,对蛋白质盐析的温度要求不严格,可在室温下进行。但关于某些对温度敏感的酶,要求在0℃~4℃下操作,以防范活力丧失。有机溶剂积淀法⑴基本源理有机溶剂关于好多蛋白质(酶)、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生积淀作用,是较早使用的积淀方法之一。其积淀作用的原理主若是降低水溶液的介电常数,溶剂的极性与其介电常数亲近相关,极性越大,介电常数越大,如20℃时水的介电常数为80,而乙醇和***,所以向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数,减小溶剂的极性,从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的互相作用力,增加了蛋白质分子间的互相作用,以致蛋白质溶解度降低而积淀。溶液介电常数的减少就意味着溶质分子异性电荷库仑引力的增加,使带电溶质分子更易互相吸引而凝集,从而发生积淀。另一方面,由于使用的有机溶剂与水互溶,它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子,破坏了蛋白质分子的水膜,所以发生积淀作用。生物大分子制备生物大分子制备7/34生物大分子制备有机溶剂积淀法的优点是:①分辨能力比盐析法高,即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内积淀。②积淀不用脱盐,过滤比较简单(如有必要,可用透析袋脱有机溶剂)。所以在生化制备中有广泛的应用。其缺点是对某些拥有生物活性的大分子简单引起变性失活,操作需在低温下进行。⑵有机溶剂的选择和浓度的计算用于生化制备的有机溶剂的选择第一是要能与水互溶。积淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和***。积淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的积淀剂是乙醇。进行积淀操作时,欲使溶液达到必然的有机溶剂浓度,需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算:V=V0(S2-S1)/(100-S2)式中:V=需加入100%浓度有机溶剂的体积V0=原溶液体积S1=原溶液中有机溶剂的浓度S2=所要求达到的有机溶剂的浓度100是指加入的有机溶剂浓度为100%,如所加入的有机溶剂的浓度为95%,上式的(100-S2)项应改为(95-S2)。上式的计算由于未考虑混溶后体积的变化和溶剂的挥发情况,实质上存在必然的误差。有时为了获取积淀而不重视于进行分别,可用溶液体积的倍数:如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂,来进行有机溶剂积淀。⑶有机溶剂积淀的影响因素①温度:多数蛋白质在有机溶剂与水的混杂液中,溶解度随温度降低而下降。值得注意的是大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感,温度稍高就会引起变性,且有机溶剂与水混杂时产生放热反响,所以有机溶剂必定起初冷至较低温度,操作要在冰盐浴中进行,加入有机溶剂时必定缓慢且不断搅拌省得局部过浓。一般规律是温度越低,获取的蛋白质活性越高。②样品浓度:样品浓度对有机溶剂积淀生物大分子的影响与盐析的情况相似:低浓度样品要使用比率更大的有机溶剂进行积淀,且样品的损失较大,即回收率低,拥有生物活性的样品易产生稀释变性。但关于低浓度的样品,杂蛋白与样品共积淀的作用小,有利于提高分别收效。反之,关于高浓度的样品,能够节约有机溶剂,减少变性的危险,但杂蛋白的共积淀作用大,分别收效下降。平时,使用5mg/mL~20mg/mL的蛋白质初浓度为宜,能够获取较好的积淀分别收效。pH值:有机溶剂积淀合适的pH值,要选择在样品牢固的pH值范围内,而且尽可能选择样品溶解度最低的pH值,平时是选在等电点周边,从而提高此积淀法的分辨能力。④离子强度:离子强度是影响有机溶剂积淀生物大分子的重要因素。以蛋白质为例,盐浓度太大或太小都有不利影响,平时溶液中盐浓度以不高出5%为宜,使用乙醇的量也以不高出原蛋白质水溶液的2倍体积为宜,少量的中性盐对蛋白质变性有优异的保护作用,但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度,降低了有机溶剂积淀蛋白质的收效,平时是在低盐或低浓度缓冲液中积淀蛋白质。有机溶剂积淀法经常用于蛋白质、酶、多糖和核酸等生物大分子的积淀分别,使用时先要选择合适的有机溶剂,此后注意调整样品的浓度、温度、pH值和离子强度,使之达到最正确的分别收效。积淀所得的固体样品,若是不是马上溶解进行生物大分子制备生物大分子制备8/34生物大分子制备下一步的分别,则应尽可能抽干积淀,减少其中有机溶剂的含量,如若必要能够装透析袋透析脱有机溶剂,省得影响样品的生物活性。选择性变性积淀法这一方法是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差别,选择必然的条件使杂蛋白等非目的物变性积淀而获取分别提纯,称为选择性变性积淀法。常用的有热变性、选择性酸碱变性和有机溶剂变性等。⑴热变性利用生物大分子对热的牢固性不同样,加热高升温度使某些非目的生物大分子变性积淀而保留目的物在溶液中。此方法最为简略,不需耗资任何试剂,但分别效率较低,平时用于生物大分子的初期分别纯化。⑵表面活性剂和有机溶剂变性不同样蛋白质和酶等关于表面活性剂和有机溶剂的敏感性不同样,在分别纯化过程中使用它们能够使那些敏感性强的杂蛋白变性积淀,而目的物仍留在溶液中。使用此法时平时都在冰浴或冷室中进行,以保护目的物的生物活性。⑶选择性酸碱变性利用蛋白质和酶等关于溶液中酸碱不同样pH值的牢固性不同样而使杂蛋白变性积淀,平时是在分别纯化流程中附带进行的一个分别纯化步骤。等电点积淀法等电点积淀法是利用拥有不同样样电点的***电解质,在达到电中性时溶解度最低,易发生积淀,从而实现分其他方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是***电解质,能够利用此法进行初步的积淀分别。但是,由于好多蛋白质的等电点十分凑近,而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有必然的溶解度,不能够完满积淀析出,所以,单独使用此法分辨率较低,收效不理想,所以此法常与盐析法、有机溶剂积淀法或其他积淀剂一起配合使用,以提高积淀能力和分别收效。此法主要用于在分别纯化流程中去除杂蛋白,而不用于积淀目的物。有机聚合物积淀法有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的积淀剂,最早应用于提纯免疫球蛋白和积淀一些细菌和病毒。近来几年来广泛用于核酸和酶的纯化。其中应用最多的是聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH>(n4)(PolyethyleneGlycol简写为PEG),它的亲水性强,溶干水和好多有机溶剂,对热牢固,有广泛围的分子量,在生物大分子制备中,用的很多的是分子量为6000~20000的PEG。PEG的积淀收效主要与其自己的浓度和分子量相关,同时还受离子强度、溶液pH和温度等因素的影响。在必然的pH值下,盐浓度越高,所需PEG时浓度越低,溶液的pH越凑近目的物的等电点,积淀所需PEG的浓度越低。在必然范围内,高分子量和浓度高的PEG积淀的效率高。以上这些现象的理论讲解还都可是是假设,未获取充分的证明,其讲解主要有:①认为积淀作用是聚合物与生物大分子发生共积淀作用。②由于聚合物有较强的亲水性,使生物大分子脱水而发生积淀。③聚合物与生物大分子之间以氢键互相作用形成复合物,在重力作用下形成积淀析出。④经过空间地址排斥,使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生积淀。本方法的优点是:①操作条件平和,不易引起生物大分子变性。②积淀效能高,使用很少量的PEG即能够积淀相当多的生物大分子。③积淀后有机聚合物简单去除。生物大分子制备生物大分子制备9/34生物大分子制备透析自ThomasGraham1861年发明透析方法到此刻已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简略最常用的分别纯化技术之一。在生物大分