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具有鳞翅目活性的新的苏云金芽孢杆菌基因的制作方法 1.docx


文档分类:医学/心理学 | 页数:约104页 举报非法文档有奖
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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。具有鳞翅目活性的新的苏云金芽孢杆菌基因的制作方法具有鳞翅目活性的新的苏云金芽孢杆菌基因的制作方法本发明提供获自苏云金芽孢杆菌(Bacillus?thuringiensis)菌株的核酸,及其变体和其片段,其编码具有针对包括鳞翅目的虫害的杀虫活性多肽。本发明的特定实施方式提供编码杀虫蛋白的分离的核酸、杀虫组合物、DNA构建体,和包含实施方式的核酸的转化的微生物和植物。所述组合物用于控制害虫尤其是植物害虫的方法。【专利说明】具有鳞翅目活性的新的苏云金芽孢杆菌基因发明领域[0001]本发明涉及从新的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)基因获得的天然存在的核酸和重组核酸,所述基因编码以抗虫害杀虫活性为特征的杀虫多肽。本发明的组合物和方法使用所公开核酸及其所编码的杀虫多肽来控制植物疫害。[0002]发明背景[0003]虫害是世界农作物损失的主要因素。例如,粘虫进食、黑切根虫损害或欧洲玉米螟损害可以在经济上摧毁农业生产者。仅欧洲玉米螟攻击田地和甜玉米带来的虫害相关的农作物损失就已在损害和控制开销上达到每年十亿美元。[0004]传统地,影响虫害群体的主要方法是应用广谱化学杀昆虫剂。然而,消费者与政府调节员一样越来越关心与生产和使用合成的化学杀虫剂相关的环境危害。调节员出于这种关心已禁止或限制使用一些更为危险的杀虫剂。因此,开发替代杀虫剂具有实质性利益。[0005]使用诸如真菌、细菌或其它昆虫物种的微生物剂对农业上重要的虫害进行生物学控制,这为合成的化学杀虫剂提供了对环境友好且具有商业吸引力的替代途径。一般来讲,使用生物杀虫剂造成污染和环境危害的风险较低,并且生物杀虫剂相对于传统广谱化学杀昆虫剂的性质提供了更强的靶标特异性。此外,生物杀虫剂的生产成本通常更低,并因而提高大量品种的农作物的经济收益。[0006]已知芽孢杆菌属的某些种的微生物具有抗广谱虫害的杀虫活性,所述虫害包括鱗翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、銷翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)及其它。苏云金芽孢杆菌(Bt)和甲虫芽孢杆菌(Bacilluspapilliae)属于迄今所发现的最为成功的生物控制剂。昆虫致病性还归因于幼虫芽孢杆菌()、缓病芽孢杆菌()、球形芽抱杆菌()(Harwook,ed.,((1989)Bacillus(芽抱杆菌)(PlenumPress),306)和腊状芽抱杆菌()(W096/10083)菌株。虽然也已从营养生长期的芽孢杆菌分离出杀虫蛋白,但是杀虫活性看上去集中在伴孢晶体蛋白包涵体上。已分离并表征编码这些杀虫蛋白的数种基因(参见,例如,美国专利第5,366,892号和第5,840,868号)。[0007]微生物杀昆虫剂,特别是获自芽孢杆菌菌株的那些,作为化学疫害控制的替代品在农业上起重要作用。近来,农业科研工作者通过基因工程改造农作物植物来产生来自芽孢杆菌的杀虫蛋白,已开发出具有增强的昆虫抗性的农作物植物。例如,玉米和棉花植物已被基因工程化以产生分离自Bt菌株的杀虫蛋白(参见,例如,Aronson(2002)(3):417-425;Schnepfetal.(1998)(3):775-806)。这些基因工程农作物现在广泛用于美国农业,并且向农民提供了传统昆虫控制方法的环境友好替代品。此外,已向美国农民销售经基因工程改造而包含杀虫的Cry***的马铃薯。这些基因工程改造的抗昆虫的农作物植物已被证明在商业上非常成功,但是它们仅提供对小范围的商业上重要虫害的抗性。[0008]因此,仍需要具有更广泛的抗虫害杀昆虫活性的新的Bt***,例如对鳞翅目中更多品种的昆虫具有活性的***。此外,仍需要具有抗更多虫害活性的生物杀虫剂和具有改良杀昆虫活性的生物杀虫剂。[0009]发明概述[0010]本发明提供影响虫害的组合物和方法。更具体地,本发明的实施方式涉及影响昆虫的方法,所述方法利用编码杀昆虫肽的核苷酸序列,从而产生表达实施方式中的杀昆虫多肽的转化的微生物和植物。这些害虫包括农业上重要的害虫,诸如,例如,欧洲玉米螟(欧洲玉米螟(OstrinianubilalisHiibner))和秋粘虫(草地夜蛾(SpodopterafrugiperdaJESmith))。在一些实施方式中,该核苷酸序列编码对属于鳞翅目的至少一种昆虫具有杀虫性的多肽。[0011]实施方式提供核酸及其片段和其变体,其编码具有抗虫害杀虫活性的多肽(例如,编码SEQIDNO:2的SEQIDNO:1)。实施方式的野生型(例如,天然存在的)核苷酸序列编码新的杀昆虫肽,所述核苷酸序列获得自Bt。实施方式还提供所公开的编码生物学活性(例如,杀昆虫)多肽的核苷酸序列的片段及变体。[0012]实施方式还提供分离的杀虫(例如,杀昆虫)多肽,其由实施方式的天然存在的核酸或经修饰的(例如,突变的或经操作的)核酸所编码。在特定实例中,实施方式的杀虫蛋白包括全长蛋白和多肽的片段,其产生自突变的核酸,所述核酸经设计以将特定氨基酸序列引入实施方式的多肽。在特定实施方式中,所述多肽相对于其衍生自的天然存在的多肽具有增强的杀虫活性。[0013]实施方式的核酸还可以用于产生转基因的(例如,转化的)单子叶或双子叶植物,所述植物的特征在于基因组包含至少一个稳定整合的核苷酸构建体,所述构建体包含实施方式的编码序列,所述编码序列与驱动所编码杀虫多肽表达的启动子可操作地连接。因此,还提供转化的植物细胞、植物组织、植物及其种子。[0014]在特定实施方式中,可以使用经优化而在宿主植物中提高表达的核酸来产生转化的植物。例如,可以回译(backtranslate)实施方式的一种杀虫多肽,从而产生包含为在特定宿主中表达而优化的密码子的核酸,所述特定宿主例如诸如玉米(Zeamays)植物的农作物植物。这种转化的植物(例如,双子叶或单子叶植物)表达编码序列,从而导致产生杀虫多肽,并赋予所述植物增加的昆虫抗性。一些实施方式提供表达杀虫多肽的转基因植物,所述杀虫多肽用于影响各种虫害的方法。[0015]实施方式还包括含有实施方式的杀昆虫多肽的杀虫或杀昆虫组合物,并且可以任选地包括另外的杀昆虫肽。实施方式包括将该组合物应用于虫害环境,从而影响虫害。[0016]发明详述[0017]本发明的实施方式涉及影响虫害、特别是植物疫害的组合物和方法。更为具体地,实施方式的分离的核酸及其片段和其变体包含编码杀虫多肽(例如蛋白)的核苷酸序列。所公开的杀虫蛋白对诸如但不限于鳞翅目虫害的虫害具有生物学活性(例如杀虫性)。目的虫害包括但不限于:欧洲玉米螟(欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis))和秋粘虫(草地夜蛾(SpodopterafrugiperdaJESmith))。[0018]实施方式的组合物包含分离的核酸及其片段和其变体,其编码杀虫多肽、包含实施方式的核苷酸序列的表达盒、分离的杀虫蛋白和杀虫组合物。一些实施方式提供经修饰的杀虫多肽,所述多肽的特征在于相对于相应野生型蛋白的杀虫活性具有改良的抗鳞翅目杀昆虫活性。实施方式还提供用这些新的核酸转化的植物和微生物,以及涉及将该核酸、杀虫组合物、转化生物体及其产物用于影响虫害的方法。[0019]实施方式的核酸和核苷酸序列可以用于转化任何生物体,从而产生所编码的杀虫蛋白。所提供的方法涉及将该转化生物体用于影响或控制植物疫害。实施方式的核酸和核苷酸序列还可以用于转化诸如叶绿体的细胞器(McBrideetal.(1995)Biotechnology13:362-365;和Kotaetal.(1999):1840-1845)。[0020]实施方式还涉及鉴定编码生物学活性杀虫蛋白的天然存在的编码序列片段和变体。实施方式的核苷酸序列直接用于影响疫害、特别是诸如鳞翅目疫害的虫害的方法。因此,实施方式提供影响虫害的新方法,所述方法不依赖传统的合成的化学杀昆虫剂的使用。实施方式涉及发现天然存在的、可生物降解的杀虫剂以及编码它们的基因。[0021]实施方式还提供同样编码生物学活性(例如,杀虫)多肽的天然存在的编码序列片段和变体。实施方式的核酸包括经优化用于特定生物体的细胞表达的核酸或核苷酸序列,例如使用植物偏好密码子,以具有增强杀虫活性的多肽氨基酸序列为基础而回译(即反向翻译)的核酸序列。实施方式还提供突变,所述突变赋予实施方式的多肽改良的或改变的性质。参见,例如,共同未决的2003年6月25日提交的美国申请第10/606,320号和2003年12月24日提交的第10/746,914号。[0022]在随后的描述中,广泛使用了大量术语。为促进对实施方式的理解,提供以下定义。[0023]可以用SI可接受的形式表示单位、前缀和符号。除非另有所指,分别地,核酸以5’至3’方向从左向右书写;氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。数字范围包括限定该范围的数字。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-1UB生物化学命名委员会推荐的一字母符号来表示。同样地,可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。参考说明书整体更为充分地定义以上定义的术语。[0024]如本文所用,“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物,并且除非另有限制,包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如,肽核酸),所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。[0025]如本文所用,术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时,指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。编码蛋白的核酸可以包含位于该核酸翻译区内的非翻译序列(例如,内含子)或者可以缺少这样的居间非翻译序列(例如,如同在cDNA中)。[0026]如本文所用,涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。[0027]如本文所用,用于核苷酸序列方向上下文的术语“反义”涉及二倍多核苷酸序列,所述多核苷酸序列以转录该反义链的方向与启动子可操作地连接。该反义链与内源转录产物充分互补,以致该内源转录产物的翻译通常受抑制。因而,将术语“反义”用于特定核苷酸序列的上下文时,该术语涉及该参考转录产物的互补链。[0028]本文可互换地使用术语“多肽”、“肽”和“蛋白”,以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物,其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。[0029]本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”,以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸,并且除非另有限制,可以包括天然氨基酸的已知类似物,所述类似物可以以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。[0030]可以从本文公开的核酸或者使用标准分子生物学技术制备实施方式的多肽。例如,可以通过在适当宿主细胞中表达实施方式的重组核酸,或可选择地通过间接体内(exvivo)方法的组合,来制备实施方式的蛋白。[0031]如本文所用,可以互换地使用术语“分离的”和“纯化的”,以涉及核酸或多肽或其生物学活性部分,其基本上或本质上不含如在其天然存在的环境中所发现的通常伴随或反应于该核酸或多肽的组分。因而,用重组技术产生分离的或纯化的核酸或多肽时,分离的或纯化的核酸或多肽基本上不含其它细胞物质或培养基,或者化学合成分离的或纯化的核酸或多肽时,基本上不含化学前体或其它化学品。[0032]“分离的”核酸通常不含在该核酸所衍生自的生物体的基因组DNA中天然侧翼于该核酸(即位于该核酸5’和3’端的序列)的序列(诸如,例如编码蛋白的序列)。例如,在各种实施方式中,所分离的核酸可以包含少于约5kb,4kb,3kb,2kb,Ikb,,所述核苷酸序列在该核酸所衍生自的细胞的基因组DNA中天然侧翼于该核酸。[0033]如本文所用,将术语“分离的”或“纯化的”用于涉及实施方式的多肽时,指分离的蛋白基本上不含细胞物质并且包含具有少于约30%,20%,10%或5%(干重计)的污染蛋白的蛋白制备物。当重组地产生实施方式的蛋白或其生物学活性部分时,培养基代表少于约30%,20%,10%或5%(干重计)的化学前体或非目的蛋白化学品。[0034]贯穿申请文件,将词语“prising)”或诸如“prises)”或“prising)”的变体理解成提示包含所称元素、整数或步骤,或者元素、整数或步骤的组,而非排除任何其它元素、整数或步骤,或者元素、整数或步骤的组。[0035]如本文所用,术语“影响虫害”指对任何发育阶段的昆虫进食、生长和/或行为的有影响的改变,包括但不限于杀灭昆虫、延迟生长、阻碍生殖能力、拒食素活性等等。[0036]如本文所用,将术语“杀虫活性”和“杀昆虫活性”同义地使用以指生物体或物质(诸如,例如蛋白)的活性,其测量可以通过但不限于害虫死亡率、害虫体重减少、害虫驱避性(r印ellency)以及进食和暴露适当长时间后害虫的其它行为和物理变化。因而,具有杀虫活性的生物体或物质不利地影响至少一种可测量的害虫健康参数。例如,“杀虫蛋白”是自身显示或与其它蛋白组合显示杀虫活性的蛋白。[0037]如本文所用,术语“杀虫有效量”指存在于害虫环境的具有杀虫活性的物质或生物体的量。对每一物质或生物体而言,通过经验来确定在特定环境中受影响的每一害虫的杀虫有效量。类似地,当害虫是昆虫时,“杀昆虫有效量”可以用于指“杀虫有效量”。[0038]如本文所用,术语“重组工程化的”或“工程化的”指利用重组DNA技术引入(例如工程化)蛋白结构的改变,这基于对蛋白作用机制的理解以及对被引入、被缺失或被取代的氨基酸的考虑。[0039]如本文所用,术语“突变核苷酸序列”或“突变”或“诱变的核苷酸序列”指经诱变或改变而包含一个或多个核苷酸残基(例如碱基对)的核苷酸序列,所述核苷酸残基不存在于相应的野生型序列中。这样的诱变或改变由核酸残基的一个或多个添加、缺失或取代或替换所组成。当通过添加、移除或替换蛋白水解位点的氨基酸来制备突变时,这样的添加、移除或替换可以在该蛋白水解位点基序内或邻近该基序,只要完成了突变的目的(即只要改变了该位点的蛋白水解)。[0040]突变体核苷酸序列可以编码突变体杀昆虫***,所述***显示改良的或降低的杀昆虫活性,或者可以编码氨基酸序列,所述氨基酸序列赋予包含它的多肽改良的或降低的杀昆虫活性。如本文所用的,蛋白、多肽或氨基酸序列上下文的术语

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