具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及新颖酶AlyDW的制作方法.docx

该【具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及新颖酶AlyDW的制作方法 】是由【开心果】上传分享，文档一共【24】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及新颖酶AlyDW的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及新颖酶AlyDW的制作方法专利名称:具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及新颖酶AlyDW的制作方法具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及新颖酶AIyDW技术领域:本发明涉及具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及新颖酶AlyDW(MetagenomeLibrarieswithAlginateLyaseActivityandNovelEnzymeAlyDff)。背景技术:海藻类作为在韩国沿近海大量栖息的生物,是一种潜在资源。大部分的海藻类经过简单加工之后可供食用,但是,将来有望成为用作生物能源或者功能性食品及医药原料的资源。海藻类的组成成分大部分是多糖类,但是盐分含量较高,表层被粘液性的多糖体所包裹。因此,为了利用海藻类作为资源,首先应当伴随多糖体的分解。纤维素和琼脂等多糖体作为￠-1,4-配糖(glycoside),能够被多种微生物分解。但是,利用陆地植物体的多糖体作为基质的微生物和利用海藻类的多糖体作为基质的微生物在栖息环境或基质的***度方面互不相同。例如,在对黄褐盒管藻的细胞壁分解能力优秀的细菌进行几次继代培养的情况下,能够确认细胞壁分解能力显著下降。为了解决这种问题,需要确立分离出海藻类的多糖体分解能力优秀的多种微生物,并能够使这种微生物稳定地分解海藻类的条件。为了降低海藻酸等海藻多糖体的聚合度,通过基于盐酸、有机酸的酸水解法来降低聚合度,从而制备低分子化海藻酸。基于酸的低分子化海藻酸制备法由于在工序上进行过度的酸处理,因而需要将耐酸性装置和废弃的强酸中和后排出,由此需要大量的碱,导致工序成本变贵。但是,通过确立利用来源于鲍鱼的微生物酶,而能够在无需强酸和强碱的温和的反应条件下生成低分子化海藻酸的反应条件,从而需要确立应用从生物工程方面大量生产多糖类的技术来减少海藻类加工工序中派生的废弃物的量,并提高资源的应用度的技术。在自然环境中栖息的微生物的培养方法十分繁杂且非常苛刻。能够从实际环境生态系统分离培养的微生物小于I%,故无法通过传统的培养方法进行培养。为了克服这种困难,正在应用在不进行微生物的分离及培养的情况下,掌握细菌群集的多样性、结构及功能的分子生物学方法。其中,利用最广泛的部分是通过作为利用核酸的分子生物学方法的16SrRNA基因的碱基序列决定来进行系统分类学分析,从而正在活跃进行鉴定及应用此的研究。16SrRNA基因具有按照种类水准划分细菌的信息,该基因的碱基序列的变化对掌握微生物之间的亲缘进化关系十分有用。但是,即使通过分子生物学方法来确认存在于生态系统的微生物信息,分离出微生物并掌握所分离的微生物的特性的过程也对在基因资源的确保方面上起到十分重要的作用。由于需要新颖的功能性食品及发酵性生物资源,因而对于新颖微生物的酶的需求逐渐增加。从海洋生物的肠道(intestinaltracts)分离的裂解酶-生产微生物生产出混合有琼脂糖酶(agarase)、昆布糖酶(Iaminarase)、纤维素酶(cellulase)以及海藻酸裂解酶(alginatelyase)的海藻类-分解酶。18并且,据报道,海藻酸裂解酶按照P-消去机理(eliminationmechanism),将微生物的褐藻类分解为a-L-古罗糖醒酸(guluronicacid)(G)、^-D-甘露糖醒酸(mannuronicacid)(M)、交替的(alternating)MG(GM)以及杂聚的(heteropolymeric)MG(GM)。11从包含鲍鱼(abalone)(AF082561)>(AB120939)、(L19657)>(AY221030)-ALG-9(AB003330)的多种海洋细菌的内脏分离出这种酶。2’4’13’15迄今,在基因组(Genebank)数据库中所报告的海藻酸裂解酶为230RF程度。24根据以往的研究,许多其他微生物的海藻酸裂解酶按照两种基质特异性划分为G块-特异聚古罗糖醛酸(polyguluronate)裂解酶()及M块-特异聚甘露糖醒酸(polymannuronate)裂解酶()。19最近,发现了通过具有高等植物的根部生长促进、、人体单核(mononuclear)细胞的细胞毒性细胞因子生产的诱导、IgE的抑制、抗高血压效果等确切的生物学活性的酶来进行分解的海藻酸。5因此,海藻酸裂解酶及海藻酸低聚糖备受食品及医药品产业的研究员的瞩目。利用16srRNA基因的克隆文库的独立性培养研究提供了Alpha-、Gamma-、Epsilonproteobacteria及mollicutes相对于作为主要微生物区系的鲍鱼Haliotisdiscushannai的内脏里的所有细菌的多样性。21然而,未提供能够通过上述16srRNA基因的信息获知微生物的生物学功能的有效信息。17’23与此相对地,利用福斯质粒(fosmid)克隆系统的宏基因组文库能够确认难以培养的生物体的新颖基因。1利用直接从福斯质粒载体及处于多种环境的样本分离出的约为40kb的插入(insert)大小的上述筛选系统用于确认几丁质酶(chitinase)、脱氢酶(dehydrogenase)、氧化还原酶(oxidoreductase)、淀粉酶(amylase)、酯酶(esterase)、内切葡聚糖酶(endoglucanase)以及环状糊精酶(cyclodextrinase)等广泛的基因。^2°发明者利用宏基因组文库,在鲍鱼的肠内微生物区系中查明了高活性的海藻酸裂解酶基因。在本说明书的全文中,参照引用了多篇论文及专利文献,并标注了引用部分。所引用的论文及专利文献的揭示内容,作为参照结合在本说明书,用以更加清楚地说明本发明所属技术领域的水准及本发明的内容。发明内容本发明致力于开发出具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及AlyDW。其结果,分离出来源于鲍鱼肠内的微生物来查明了具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及新颖酶,并查明了这种新颖酶所具有的最佳活性条件,从而完成了本发明。本发明的目的在于,提供具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库。本发明的再一个目的在于,提供新颖的海藻酸裂解酶(alginatelyase)。本发明的另一个目的在于,提供对新颖的海藻酸裂解酶(alginatelyase)进行编码的核酸分子。本发明的还一个目的在于,提供包含上述核酸分子的重组载体。本发明的又一个目的在于,提供通过上述重组载体进行转化的细胞。本发明的其他一个目的在于,提供海藻酸的分解方法。本发明的目的及优点通过下面的具体实施方式、权利要求书及附图变得更加清/,本发明提供包含22个ORF的具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库。上述22个ORF包含序列目录第一序列的第1280-3652次核苷酸序列、第5025-6128次核苷酸序列、第6365-7492次核苷酸序列、第8687-9202次核苷酸序列、第9206-9823次核苷酸序列、第9823-11250次核苷酸序列、第11377-12189次核苷酸序列、第12290-13306次核苷酸序列、第13611-14642次核苷酸序列、第14646-15212次核苷酸序列、第15417-16388次核苷酸序列、第17370-19223次核苷酸序列、第19452-21017次核苷酸序列、第21253-22143次核苷酸序列、第22309-23121次核苷酸序列、第23333-24208次核苷酸序列、第24294-24989次核苷酸序列、第25446-26477次核苷酸序列、第26549-28063次核苷酸序列、第28362-29579次核苷酸序列、第30103-30930次核苷酸序列以及第31010-31696次核苷酸序列。在本说明书中,术语“核苷酸”是指以单链或双链形态存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,只要未进行特殊说明,就包含天然核苷酸的类似物(Scheit,NucleotideAnalogs,JohnWiley,NewYork(1980);UhIman及Peyman,ChemicalReviews,90543-584(1990))。优选地,上述宏基因组文库具有序列目录为第一序列的核苷酸序列,更加优选地,上述宏基因组文库是通过利用从鲍鱼的内脏的微生物区系(miCToflora)获得的基因组DNA来构建的。在本说明书中,术语“宏基因组(metagenome)”是指存在于自然界的微生物总集合,所谓的宏基因组是从土壤、海水、泥滩、河川、大气以及动物的大肠等多种自然环境中采取的微生物的DNA相互混合的形态,不是该DNA按照其种类分离的形态。并且,术语“宏基因组(metagenome)”还指以基因形态分析微生物的功能或多样性的技术。宏基因组是一种用于将作为存在于自然界的多种环境中的总微生物的染色体组的宏基因组克隆后在宿主细胞等中维持、表达,来构建宏基因组文库,从而对难培养微生物的系统进行分类,并探索有用的酶和次级代谢产物的研究。本发明的宏基因组文库能够通过本发明所属的技术领域中公知的各种方法来实施。优选地,利用黏粒((2002)-07-237031-9)及福斯质粒((July2004)."Predictingtheevolutionofantibioticresistancegenes.".NatureReviewsMicrobiology2(5).)来构建宏基因组文库。本发明的宏基因组文库的有用性在于,作为用于探索有用的酶(例如,海藻酸裂解酶)和次级代谢产物的研究手段。根据本发明的再一实施方式,本发明提供具有在序列目录为第二序列中所记载的氨基酸序列的海藻酸裂解酶(alginatelyase)。与以往的利用微生物的海藻酸分解方法不同,本发明者需要通过基于酸的低分子化海藻酸制备法来将强酸中和之后排出,而为了解除由此造成的工序成本,致力于确立能够通过分离出海藻类的多糖体分解能力优秀的微生物来稳定地分解海藻类的条件。其结果可知,采掘了新颖的海藻酸裂解酶,据此,确认了能够对海藻酸进行更加有效而更加稳定的低分子化。在本说明书中,术语“海藻酸裂解酶”是指分解由G块-特异聚古罗糖醛酸(polyguluronate)及M块-特异聚甘露糖醒酸(polymannuronate)组成的海藻酸来进行低分子化的酶。根据本发明的优选实施例,上述海藻酸裂解酶是来源于微生物的酶。最优选地,上述海藻酸裂解酶是来源于鲍鱼的肠内微生物的酶。根据本发明的另一实施方式,本发明提供对上述海藻酸裂解酶进行编码的核酸分子。最优选地,本发明的核酸分子包含由序列目录为第一序列的第15417-16388次核苷酸序列来表示的核苷酸序列。在本说明书中,术语“核酸分子”是指综合包含DNA(gDNA及cDNA)和RNA分子,在核酸分子中作为基本结构单位的核苷酸不仅包含天然的核苷酸,还包含糖或碱基部位变形的类似物(analogue)(Scheit,NucleotideAnalogs,JohnWiley,NewYork(1980);UhIman及Peyman,ChemicalReviews,90:543_584(1990))。核苷酸中的变异也包括在蛋白质中不引起变化的情况。这种核酸包含核酸分子,该核酸分子包含功能性均等的密码子或对相同的氨基酸进行编码的密码子(例如,根据密码子的简并性,相对于精氨酸或丝氨酸的密码子是六个)或者对生物学上均等的氨基酸进行编码的密码子。并且,核苷酸中的变异还会给海藻酸裂解酶本身带来变化。即使在给海藻酸裂解酶的氨基酸带来变异的情况下,也能够获得表现出与本发明的海藻酸裂解酶几乎相同的活性的变异。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,应当清楚理解,本发明的海藻酸裂解酶中能够包含的生物学功能等同替代局限于发挥与本发明的海藻酸裂解酶均等的生物学活性的氨基酸序列的变异。这种氨基酸变异基于氨基酸支链取代物的相对类似性,例如疏水性、亲水性、电荷、大小等发生。根据对于氨基酸支链取代物的大小、形态以及种类的分析可知,精氨酸、赖氨酸及组氨酸均为带阳电荷的残基;丙氨酸、甘氨酸及丝氨酸具有类似的大小;苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸具有类似的形态。因此,基于这种考虑事项,精氨酸、赖氨酸及组氨酸;丙氨酸、甘氨酸及丝氨酸;以及苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸可谓是生物学上的功能等同替代。在导入变异时,能够考虑到氨基酸的疏水性指数(hydropathicidex)。各个氨基酸根据疏水性和电荷赋予疏水性指数。上述疏水性指数异亮氨酸(+);缬氨酸(+);亮氨酸(+);苯丙氨酸(+);半胱氨酸/胱氨酸(+);蛋氨酸(+);丙氨酸(+);甘氨酸(-);苏氨酸(-);丝氨酸(-);色氨酸(-);酪氨酸(-);脯氨酸(-);组氨酸(-);谷氨酸盐(-);谷氨酰***(-);天冬氨酸盐(-);天冬酰***();赖氨酸(-);以及精氨酸(-)ο对于赋予蛋白质的交互性生物学功能(interactivebiologicalfunction)来说,疏水性氨基酸指数起到十分重要的作用。众所周知,只有用具有类似的疏水性指数的氨基酸进行取代,才能保留类似的生物学活性。在参照疏