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一种突变型载体pEGFP-N1m的构建方法及应用的制作方法.docx


文档分类:医学/心理学 | 页数:约16页 举报非法文档有奖
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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种突变型载体pEGFP-N1m的构建方法及应用的制作方法专利名称:一种突变型载体pEGFP-N1m的构建方法及应用的制作方法技术领域:本发明属于分子生物学领域,涉及一种商业化质粒PEGFP-Nl被改造为一种突变型载体pEGFP-Nlm的方法及其应用。背景技术:參录fe—力胃θ(GreenFluorescentProtein,GFP)ΜΨ^^Aequoreavictoria的水母体内产生的一种能够发出绿色荧光的蛋白质。GFP是一种由238个氨基酸(分子量约27KDa)组成的发光蛋白质——aequorin,在蓝色波长范围的光线激发下会发出绿色荧光;GFP是典型的β桶形结构,包含β折叠和α螺旋,将荧光基团包含在其中,严密的桶形结构保护着荧光基团,防止它被周围环境淬灭,内部面向桶形的侧链诱导Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化,导致荧光基团形成(.,2009,38,2823-32)。由于GFP与其他蛋白形成的融合蛋白几乎不会影响其原本的蛋白活性或流动性,也几乎不会产生细胞毒性,故在细胞生物学与分子生物学研究中,GFP作为一种重要的报告基因(importergene)被广泛应用。在应用上,能够使GFP与目的基因发生基因重组,波长约490nm的紫外线激发下,用显微镜观察绿色荧光的分布,因而可用于标记活体生物样品。尽管野生型GFP能够发出绚丽的荧光,但它还是有不少缺点,比如有两个激发峰、光稳定性不好、在37°C时不能正确地折叠等等。1996年Remington小组最先在Science杂志上发表了GFP的S65T突变体晶体结构后,人们更好地了解到GFP发光基团的组成以及与周围残基的相互作用等。研究人员通过定点或随机突变,不断地改造这些残基,得到了我们今天使用的GFP衍生物。华裔科学家钱永健(RogerYTsien)于1994年开始改造GFP,并在1995年完成了GFP单点突变(S65T)。这个突变显著提高了GFP的光谱性质,且荧光强度和光稳定性也大大增强。突变后的GFP激发波长转移至488nm,而发射峰仍保持在509nm,这和常用的FITC滤光片匹配,提高了GFP的应用潜力。而F64L点突变则改善了GFP在37°C的折叠能力,这样产生了增强型GFP(EnhancedGreenFluorecenceProtein,EGFP),也就是现在科研上所常用的EGFP。EGFP是一种优化的突变型绿色荧光蛋白,其荧光比野生型的强35倍,大大增强了其报告基因的敏感度,同时具有结构稳定、高效表达、无种系依赖性等特点,更适用于细胞基因表达和蛋白定位检测及细胞示踪标记。因此,EGFP在研究中常作为一种重要的报告基因被应用详见参考文献1).,2009,38,2823-32;2),2001,204,9-18。pEGFP-m载体(质粒图谱见图1)是一种商业化的真核细胞表达载体,携带有EGFP蛋白的表达基因,可融合于目的蛋白的N端,稳定、高效地在多种异源生物中表达且无细胞毒性,在生物医学研究中常作为一种重要的研究工具被使用。在实际应用中,通常将PEGFP-Nl载体与目的基因进行重组连接,构建重组表达质粒、转染细胞、表达融合蛋白,然后观察细胞是否表达绿色荧光蛋白、以及确定该融合蛋白的亚细胞定位。然而,在实际应用过程中,由于融合蛋白表达序列中的第二个翻译起始位点ATG在EGFP表达序列上的存在,有可能会在融合蛋白得到表达的同时,会另外表达出一个单独的EGFP蛋白,这种情况在文献报道中已经屡见不鲜(详见参考文献JacksonRJ,.,2010,11,113-27)。例如,FGF-2基因能够表达出一种分子量大小约为ISkDa的、特异性地定位于细胞核仁中的纤维原细胞生长因子;当FGF-2基因的开放阅读框(openreadframe,0RF)被重组克隆到pEGFP-Nl载体上之后,研究其亚细胞的定位情况时,除了如预期的在细胞核中表达融合蛋白外,还可以在细胞质中观察到额外表达较弱的绿色荧光蛋白GFP;这些结果通过蛋白表达检测和共聚焦显微镜观察均可以得到证实,这明显地影响了目的蛋白亚细胞定位实验结果的准确性(详见参考文献ShengJ,.,2004,279,40153-60)。又如,SARS_CoV3a蛋白是存在于SARS病毒内的一种独特蛋白,其大小为28kDa,主要定位于细胞质的高尔基体;当CoV3a蛋白的ORF被重组克隆到pEGFP-Nl载体之后,同样在细胞中其他部位也表达了额外的绿色荧光蛋白GFP,这些都影响了实验结果的准确性(详见参考文献YuanX,.,2005,109,191-202)。此外,本室于2007年发表的相关研究结果表明对于一种成熟肽只有23aa的钾通道蝎***Bmkk2而言,当其表达序列被克隆到pEGFP-m载体之后,很难得到融合蛋白;而将EGFP蛋白的翻译起始位点ATG突变后,则能够明显地提高融合蛋白的表达量(详见参考文献DaiC,.,2007,12,362-9)。这些实验证据充分说明,当我们将能够表达分子量接近或小于EGFP蛋白的ORF克隆进入pEGFP-Nl质粒后,由于“渗漏扫描”和“翻译重起始”现象的存在详细的分子机制参见文献l)Poyry,ΤΑ,.,2004,18,62-75;2)JacksonRJ,.,2010,11,113-27;3),2002,299,1-34],当第二个翻译起始位点ATG与前一个翻译起始位点的距离越为接近,就越容易使得核糖体从第二个ATG开始翻译;而当上游开放阅读框较长或是上游开放阅读框含有稳定的RNA二级结构时,重扫描和翻译重起始发生的可能性会明显地减少。因此,为了改善pEGFP-Nl质粒在被克隆进入较短的ORF后可能表达额外的EGFP蛋白而影响融合蛋白的亚细胞定位结果或影响融合蛋白的表达量这一缺陷,本发明通过定点突变研究手段,将pEGFP-Nl质粒上EGFP蛋白表达序列的Kozak序列进行了突变(采用定点突变方式,将pEGFP-TGt),得到了一种突变型载体pEGFP-Nlm。将该突变型载体与现有的商业化载体PEGFP-Nl结合使用,可以明显改善pEGFP-Nl载体在使用过程中的上述缺陷,提高了分子量接近或小于EGFP的蛋白多肽在亚细胞定位实验结果的准确性,以及提高融合蛋白的表达效率。发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种突变型载体pEGFP-Nlm的构建方法及其应用。本发明中所涉及的突变型载体pEGFP-Nlm,结合pEGFP-Nl—起应用,能够显著提高分子量接近或小于EGFP的蛋白多肽在亚细胞定位实验结果的准确性,以及提高融合蛋白的表达效率。本发明所提供的突变型载体pEGFP-Nlm的构建方法,包括如下步骤1)引物设计采用的上游引物序列为5’-TGTTGAGCAAGGGCGAGG-3,,下游引物序列为5,--3,;2)PCR定点突变以pEGFP-Nl质粒为模板,进行PCR反应;3)回收PCR反应产物,常规方法进行酶切、连接和转化;4)阳性克隆筛选以及测序鉴定,完成突变型载体pEGFP-Nlm的构建。本发明选取分子量大于、等于或小于EGFP的、亚细胞定位已知的蛋白多肽的表达序列,分别将这些表达序列克隆进入pEGFP-Nl和pEGFP-Nlm,构建相应的表达载体;通过Westernblot分析和共聚焦显微镜观察方法,证实突变型载体pEGFP-Nlm可以显著提高分子量约等于或小于EGFP的蛋白多肽的亚细胞定位结果的准确性以及提高融合蛋白的表达效率。本发明中所得到的突变型载体pEGFP-Nlm,具有明显改善分子量约等于或小于EGFP蛋白的多肽分子在亚细胞定位结果的准确性,为该商业质粒的进一步开发应用提供了重要的实验数据。图1pEGFP-Nl载体的模式图(引自Clontech公司技术手册)。图2本发明中pEGFP-Nl载体上EGFP蛋白表达序列中Kozak序列的突变策略,ATGG(图1中的674-682位核苷酸序列)TGt。图3利用pEGFP-Nl和pEGFP-Nlm构建的多种表达质粒的酶切鉴定图谱。泳道1和5=DNAmarker;泳道2:KRAB-EGFP_N1;泳道3和4=KRAB-EGFP-Nlm;泳道6=Tat-EGFP-Nl;泳道7:Tat-EGFP-mm。图4PK-EGFP融合蛋白的Westernblot检测图谱。图5PK-EGFP融合蛋白的共聚焦显微镜观测。图6融合蛋白KRAB-EGFP的Westernblot检测图谱。图7融合蛋白KRAB-EGFP的共聚焦显微镜观察。图8融合蛋白EGFP-Tat的共聚焦显微镜观察。具体实施例方式下面结合具体实施例,进一步阐述本发明具体应用方法。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法,按照常规实验条件,如Sambrook等编,《分子克隆实验室手册》(NewYorkCoIdSpringHarborlaboratoryPress,2002)中所述的实验条件,或按照制造厂商所建议的实验条件。实施例1突变型载体pEGFP-Nlm的构建将pEGFP-Nl载体中EGFP核苷酸表达序列的翻译起始位点ATG及其附近的Kozak序列采用PCR定点突变技术进行突变(如图2),使其不能得到表达;只有当插入带有翻译起始位点ATG及Kozak序列的外源基因片段之后才会高效地表达出“靶基因-EGFP融合蛋白”。一、构建突变型载体pEGFP-,上游引物序列为55’-TGTTGAGCAAGGGCGAGG-3’,下游引物序列为5,--3’(下划线所标注的序列即为定点突变的序列)。本发明中所用到的引物核苷酸序列均由深圳华大基因公司合成。二、PCR定点突变以本室保存的pEGFP-Nl质粒(由本室购自Clontech公司)为模板,采用PCR定点突变方法(采用上述引物)进行突变。构建如下PCR反应体系pEGFP-Nl质粒()1μ1;MgSO4(25mmol/L)1μ1;dNTP(dGTP、dATP、dTTP、dCTP各5mmol/L)1μ1;国产K0D+;IOXK0D+;上游引物(10ymol/L);下游引物(10ymol/L);,反应体积为25μ1。PCR反应循环为95°CIOmin;(95°C30s,58°C30s,68°C30s;35cycles);68°C5min;16°C24h。用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司的DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收PCR产物,详细的操作方法参照试剂盒说明。三、PCR产物和pEGFP-Nl质粒酶切、片段连接和转化按照常规分子克隆的方法,利用相应的限制性内切酶对于上述PCR产物和PEGFP-Nl质粒进行酶切、产物回收和连接反应,转化感受态大肠杆菌。四、阳性克隆筛选及测序验证挑取阳性克隆,进行后续的质粒提取、酶切反应和PCR反应鉴定,最后送交测序公司进行测序验证。将已鉴定好的质粒送交华大基因生物公司测序,经过序列比对,证明突变位点的质粒是正确的,即突变型载体pEGFP-Nlm构建成功。实施例2不同分子量大小的融合蛋白表达载体的构建为了比较分析pEGFP-Nl和pEGFP_Nlm载体克隆进入不同大小的蛋白多肽表达序列后,对于融合蛋白的表达效率和定位结果的影响,首先根据文献报道,挑选不同大小的、且其亚细胞定位已知的多肽表达核苷酸序列,分别克隆连接到质粒pEGFP-Nl和pEGFP-Nlm的EGFP表达序列的上游,构建成不同的表达质粒。由于实验需要,需选取大小不同的蛋白,同时需要这些蛋白符合亚细胞结构定位已知,且定位精确,能满足处于且仅处于细胞核内、细胞质内、特定细胞器内或细胞内生物膜上的条件。在NCBI蛋白数据库中,注解部分有包括蛋白亚细胞结构定位及蛋白已知功能在内的信息。运用生物信息学的方法,在Linux系统下用Perl高级程序语言可以编写相应的搜索程序,实现全面、有效且快速蛋白数据库搜索,发现符合特定条件的基因。一、***酸激酶基因***酸激酶(pyruvatekinase,PK),其生物化学缩写式为三磷酸腺苷***酸-2-0-磷酸转移酶,其基因长度为12142bp,能够编码包含574aa(分子量约62KDa,其大于约26KDa的EGFP的分子量)长度的蛋白。在无氧条件下,葡萄糖进行分解,形成2分子***酸并提供能量,这一过程称为糖酵解作用;在此过程中,PK是催化形成第二个ATP反应的酶(Liapounova,.,EukaryotCell,2006,5,2138—46)。利用常规的分子生物学方法,将PK蛋白的表达序列分别克隆进入pEGFP-m和pEGFP-Nlm的EGFP表达序列的上游,然后转染HeLa细胞,检测其表达情况。二、ZNF268锌指蛋白的KRAB结构功能域KRAB/C2H2型锌指蛋白均含有一个保守的KRAB功能结构域。ZNF268是一种典型的KRAB/C2H2型锌指蛋白,含有一个74aa的KRAB结构域(参见文献Gou,.,,1518,306-10)。我们的前期实验结果表明单

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