医学实验小技巧与知识总结.ppt

该【医学实验小技巧与知识总结 】是由【1485173816】上传分享，文档一共【23】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【医学实验小技巧与知识总结 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。OD(opticaldensity,吸光度)OD260/OD280来判断分子纯度当OD260/OD280<,表示蛋白质含量较高当OD260/OD280>,表示RNA含量较高当OD260/OD280=~,表示DNA较纯OD260/OD230的比值来判断所得到的核酸中的盐和小分子杂质的残留程度对于核酸纯制品,OD260/OD230应大于2;OD260/OD230<2说明去盐不充分用于细胞转染的质粒大提浓度最好能达到300ng/μL以上第二页,共24页。。合成公司交给你的引物成品一般是会注明有几个OD,正常情况下1个OD相当于33μg。第三页,共24页。2Tm值的简单计算第四页,共24页。3蛋白分子量估算N(氨基酸数量)×110Da第五页,共24页。4增加PCR特异性镁离子浓度镁离子影响PCR的多个方面,如DNA聚合酶的活性,引物退火,影响PCR产量和特异性。dNTP和模板同镁离子结合,降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同,(注意:对实时定量PCR,使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液)。较高的游离镁离子浓度可以增加产量,但也会增加非特异性扩增,降低忠实性。为了确定最佳浓度,从1mM到3mM,,进行镁离子滴定;促进PCR的添加剂退火温度,引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增,但是,某些模板,包括高GC含量的模板,需要其他的措施。影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获得最好的结果需要模板的完全变性。PCR添加剂,包括甲酰***,DMSO,甘油,甜菜碱以与PCRxEnhancerSolution,可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度,从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。为获得最佳结果,应优化添加剂的浓度,尤其是会抑制TaqDNA聚合酶的DMSO,甲酰***和甘油。第六页,共24页。5RNA提取与验证RNA完美提出来的话应该是三条带:28s,18s,;28s和18s比较亮,而且28s是18s的2倍量,,可有可无;,,(人)第七页,共24页。6质粒电泳图解第八页,共24页。7细胞培养瓶(板)生长面积容量与细胞数24孔板长满了细胞大约有3X105个细胞。如果一天后要长到70%(),-。因为细胞刚放进去的前几个小时需要粘在生长表面与适应新的生长条件,不会达到24小时翻一倍的速度。大约数目96孔板4~,共24页。8KozaksequenceKozak规则,即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律,若将第一个ATG中的碱基A,T,G分别标为1,2,3位,则Kozak规则可描述如下:(1)第4位的偏好碱基为G;(2)ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T;(3)在-3,-6和-9位置,G是偏好碱基;(4)除-3,-6和-9位,在整个侧翼序列区,C是偏好碱基。需要指出的是,Kozak规则是基于已知数据的统计结果,并不绝对,而且对于不同的物种有所差别。第十页,共24页。9加Kozarksequence()是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的AUG环境,避免ribosome(核糖体)出现leakyscan第十一页,共24页。10