一种含有vegfa基因3′utr和报告基因的重组质粒的制作方法.docx

该【一种含有vegfa基因3′utr和报告基因的重组质粒的制作方法 】是由【开心果】上传分享，文档一共【14】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【一种含有vegfa基因3′utr和报告基因的重组质粒的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。一种含有vegfa基因3′utr和报告基因的重组质粒的制作方法专利名称:一种含有vegfa基因3′utr和报告基因的重组质粒的制作方法技术领域:本发明涉及一种重组质粒,具体地,涉及一种含有VEGFA基因3'UTR和报告基因的重组质粒。背景技术:VEGFA的全称为vascularendothelialgrowthfactorA,其中文名为血管内皮生长因子A。血管生成刺激因素包括有一类称为“血管生成因子(antigenicgrowthfactors)”的细胞因子,起着刺激新血管形成的作用。目前已经发现了一些血管生成刺激因子,如血小板源性生长因子(TOGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、转换生长因子(TGF)、血管内皮细胞生长因子A(VEGFA)等,其中在肿瘤血管生成中起关键作用的是VEGFA。VEGFA蛋白由肿瘤细胞、巨噬细胞及纤维母细胞等分泌,广泛分布于人体许多组织,如腺体、肺、肝、肾、心肌等,但表达水平极低,其作用仅维持正常血管密度和基本渗透功能,维持营养物质。当出现肿瘤细胞之后,其表达水平一般会大大上升。有研究表明,VEGFA与肿瘤侵染性相关,与肿瘤易感性亦相关。VEGFA的主要功能包括(I)选择性增强血管内皮细胞有丝分裂,刺激内皮细胞增殖并促进血管形成。(2)升高血管尤其是微小血管的渗透性,使血浆大分子外渗沉积在血管外基质中,为肿瘤细胞的生长和新生毛细血管网的建立提供营养。随着人类基因组计划的完成和模式生物基因组计划的进行,人们对于占人类基因组95%以上的非编码序列的研究日益加强,研究发现它们中很多是具有生物学功能和意义的片段,在这些研究之中,对于大小约21-23个碱基的单链小分子RNA的microRNA的研究则是最为热点之一。在近几年中的肿瘤的研究中,有关于microRNA对于肿瘤的功能与调控的研究一直是肿瘤治疗领域的热点之一,同时也取得了很大的突破与进展。目前研究表明,microRNA主要是通过结合到靶标基因的3'UTR区域,进而抑制靶标基因的转录,因此基因的3'UTR的抑制程度能够指示该基因受到miCToRNA抑制的水平。然而,现阶段对于血管生成与microRNA的相关研究报道并不多见,而对于VEGFA蛋白与microRNA的研究就更为少见了,同时目前也没有一种简便,快捷的方法来筛选能够抑制多药耐药蛋白的microRNAο发明内容本发明的目的是提供一种含有血管内皮成长因子A(VEGFA)基因3'UTR序列和报告基因的重组质粒,可以用于血管生成相关的miCToRNA的筛选。为了达到上述目的,本发明提供了一种含有VEGFA基因3'UTR和报告基因的重组质粒,其中,所述的报告基因为萤火虫荧光素酶基因。上述的含有VEGFA基因3丨UTR和报告基因的重组质粒,其中,所述的重组质粒的制备方法包含步骤I,对载体质粒进行扩增和抽提;步骤2,对VEGFA基因的3'UTR序列进行克隆、酶切及纯化;步骤3,进行所述的VEGFA基因的3'UTR序列与所述的载体质粒的连接;步骤4,筛选重组子。上述的含有VEGFA基因3'UTR和报告基因的重组质粒,其中,所述的步骤I包含用所述的载体质粒转化大肠杆菌感受态细胞,进行扩增;然后采用碱裂解法抽提制备所述的载体质粒,电泳检测所述载体质粒的纯度和含量;再用NcoI和HindIII对所述载体质粒进行酶切,试剂盒凝胶回收大片段的酶切产物。碱裂解法是提取质粒的最常用也最有效的方法,是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异达到分离目的。其原理是高PH使质粒DNA和染色体DNA变性,同时沉淀蛋白质。再将pH值调至中性,质粒DNA较小,很容易复性成双链。而染色体DNA较大,不会复性,缠结成网状不溶物质,从而可以通过离心除去。具体方法为依次加入下面三种溶液,然后进行离心:溶液I:葡萄糖50mmol/L,EDTA100mmol/L,Tris-Cl25mmol/L,溶菌酶5mg/ml,调整pH为8·O;,SDS1%;溶液35mol/LKAc60ml,,。其中溶液I作用主要是悬浮菌体,溶液2作用是裂解菌体,释放胞内物质,溶液3是沉淀染色体DNA。上述的含有VEGFA基因3'UTR和报告基因的重组质粒,其中,,根据人的VEGFA基因的3'UTR区序列设计两端引物引物I为上游5'端引物,其中包含19个VEGFA基因的3'UTR互补碱基,一个HindIII识别位点,3个保护碱基;弓丨物2为下游3'端引物,其中包含19个VEGFA基因3'UTR互补碱基,一个NcoI识别位点,4个保护碱基。,以基因组DNA为模板,利用常规PCR反应进行扩增;,反应结束后,取5μI反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测;,取反应产物,琼脂糖凝胶电泳后,切胶,用凝胶回收试剂盒回收;,将回收的PCR产物用NcoI和HindIII双酶切,再次回收以备连接使用。上述的含有VEGFA基因3'UTR和报告基因的重组质粒,其中,所述的引物I为5’-AGGAAAGACTGAT-3’,其中AAGCTT为HindIII识别位点。上述的含有VEGFA基因3'UTR和报告基因的重组质粒,其中,所述的引物2为5’-ACAGCAGT-3’,ATGG为NcoI识别位点。上述的含有VEGFA基因:VUTR和报告基因的重组质粒,其中,所述的PCR反应,采用ExTaqDNA聚合酶,反应条件为在95°C预变性3min,再在95°C变性30s,然后在55°C退火45s,再在72°C延伸Imin;进行40个循环,最后在72°C最终延伸5min,扩增完后于4°C长期保温。上述的含有VEGFA基因3'UTR和报告基因的重组质粒,其中,所述的步骤3的连接是所述的步骤3的连接采用DNA连接试剂盒,进行连接反应,16°C过夜。上述的含有VEGFA基因3'UTR和报告基因的重组质粒,其中,所述的步骤4包含取连接产物直接转化感受态大肠杆菌;经过含有氨苄青霉素的LB培养基中选择培养;从培养平板上随机挑取菌落,扩增培养后用碱裂解法提取质粒备用;最后经过酶切、PCR、测序鉴定。上述的含有VEGFA基因3'UTR和报告基因的重组质粒,其中,所述的重组质粒可以用于检测microRNA抑制VEGFA基因表达的作用影响。本发明提供的含有VEGFA基因3'UTR和报告基因的重组质粒具有以下优点(I)本发明在后续应用中,具有灵敏度高、检测速度快、费用低、不需使用放射性同位素等优点。(2)本发明同时具有靶向性的特点,能够用来特异性检测microRNA抑制基因3'UTR的活性。(3)本发明还能够克服转染效率对结果的影响。图I为本发明的VEGFA基因3'UTR序列克隆产物的电泳示意图。图2为本发明的含有VEGFA基因3'UTR和报告基因的重组质粒NcoI和HindIII双酶切检测的电泳示意图。图3为本发明的含有VEGFA基因3'UTR和报告基因的重组质粒的测序结果与基因库所查序列的比对图。具体实施例方式以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步地说明。、质粒以及试剂等的准备。。质粒pGL3_promoter为实验室保存。试剂ExTaqDNA聚合酶,限制性内切酶Hindlll、NcoI和DNA连接试剂盒(DNALigationKit)购自TaKaRa公司。DL2000分子标记(DL2000marker)和λDNA/HindIII分子标记(λDNA/HindIIImarker)购自上海MajorBio公司。质粒回收试剂盒和DN***段回收试剂盒购自北京TIANGEN公司。其余试剂购自上海MajorBio公司。LB培养基的配制配制1000mlLB培养基称取细菌培养用胰蛋白胨10g,细菌培养用酵母提取物5g,NaCl10g并溶解于950ml去离子水中。。高压蒸汽灭菌20min。铺制平板的培养基应先按照上面方法配置液体LB培养基,灭菌前加入琼脂15g/L。在超净工作台中将未凝固的培养基倒入培养皿中。含氨苄LB培养基即在上述培养基高温高压灭菌后,冷却至60°C左右。每1000mlLB培养基加入ImlAmpicillin(100mg/ml),4°C保存。二·重组质粒的构建。步骤一pGL3_promoter质粒的转化、大量扩增、抽提。。(I)事先将恒温水浴锅的温度调到42V.(2)从-80°C超低温冰柜中取出一管(200μL)感受态菌,冰浴融化。(3)加入5μI质粒(DNA含量不超过IOOng),轻轻混匀后放置冰上30min。(4)从冰中取出,放入42°,然后迅速放回冰中,静置5min。(5)在超净工作台中向上述管中加入ImlLB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,然后固定到摇床的弹簧架上37°C震荡lh。(6)在超净工作台中取上述转化混合液200μL,滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀(注意玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂)。(7)在涂好的培养皿上做上标记,先放置在37°C恒温培养箱中30_60min直到表面的液体都渗透到培养基里后,再倒置过来放入37°C恒温培养箱过夜。(8)观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好。。在上述平板上挑取单个菌落于7mlLB培养基(含Ampicillin)中,然后固定到摇床的弹簧架上37°C震荡过夜。,具体步骤见下。(I),彻底去除上清。(2)加入IOOml溶液I,用枪头或振荡器充分悬浮细菌,冰浴2分钟。(3)加200ml溶液II,立即温和混匀,使细菌裂解,室温放置Imin。(4)加入350ml溶液III,立即上下颠倒数次,使之充分中和,室温放置I分钟。(5)12000rpm,离心5分钟。(6)-10柱中,放置两分钟,8000rpm室温离心I分钟。(7)弃收集管中的废液,将离心柱放入同一支收集管中,吸取500ml漂洗液到离心柱中,8,OOOrpm室温离心I分钟。(8)重复上一步骤。(9)弃收集管中的废液,将离心柱放入同一支收集管中,IOOOOrpm室温离心30秒以彻底去除漂洗液。(10),加50ml洗脱缓冲液(ElutionBuffer),室温放置2分钟后,IOOOOrpm室温离心I分钟。离心管中的溶液即为所抽提的质粒DNA。%琼脂糖凝胶电泳检测质粒的纯度和含量。(I),加入Iml50XTAE配制成1%的溶液。(2)于微波炉中加热至液体沸腾,取出锥形瓶摇晃赶出底部及侧壁气泡,重新放回微波炉中加热,如此三次,至琼脂糖完全溶解。(3)将锥形瓶中溶液室温冷却至温热,滴入一滴EB,摇晃混匀,溶液呈淡红色。(4)将合适大小的梳子插入清洗晾干的胶模中,以上配置好的溶液缓缓倒入该胶模中。凝胶厚度约为3至5mm之间,-。(5)在凝胶完全凝固后(约30min),小心地移去梳子。(6)将凝胶放入电泳槽中,加入恰好没过胶面约I_的IXTAE电泳缓冲液。(7)样品与所需加样缓冲液混合后,用微量移液器,将其加至样品槽中。(8)通电,110V稳定电压。电泳染料溴酚蓝在凝胶中迁移出适当距离。(9)切断电源,取出凝胶。(10)在紫外灯下检查凝胶,并用凝胶成像系统记录结果。,体系如下质粒3μ1NcoI(IOU/μ):μHindIII(IOU/μ):μIOXkBuffer:2μ1BSAμddH20:12μ1共20μ1。按以上双酶切体系配制并离心混匀,37°C酶切过夜。。(I)酶切产物中加入5倍体积的结合液BD,充分混匀。(2)将吸附柱放入收集管中,用移液器将上一步所得溶液转移至吸附柱中,12000rpm室温离心30秒,倒掉滤液。(3)将吸附柱中加入600μI漂洗液WB,12000rpm室温离心I分钟,倒掉滤液。(4)将吸附柱于12000rpm室温离心2分钟,除去残留的漂洗液WB,将吸附柱室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。漂洗液WB的残留会影响DNA的纯化得率。(5)取出吸附柱,,,室温静置I分钟。12000rpm室温离心I分钟洗脱DNA,重复本操作一次,收集管中溶液。步骤二=VEGFA基因的YUTR序列的克隆、酶切及纯化。根据人的VEGFA基因的3'UTR区序列设计两端引物引物I为上游Y端引物,其中包含19个VEGFA基因的YUTR互补碱基,一个HindIII识别位点,3个保护碱基。引物2为下游Y端引物,其中包含19个VEGFA基因:VUTR互补碱基,一个NcoI识别位点,4个保护碱基。引物I:5’-AGGAAAGACTGAT-3’。引物2:5’-ACAGCAGT-3’。以基因组DNA为模板,利用常规PCR反应进行扩增。反应条件为在95°C预变性3min,再在95°C变性30s,然后在55°C退火45s,再在72°C延伸Imin;进行40个循环,最后在72°C最终延伸5min,扩增完后于4°C长期保温。反应结束后,%琼脂糖凝胶电泳检测;取100μIPCR产物,琼脂糖凝胶电泳。结果如图I所示,图中的标记条带(Marker)为DL5000,1-5为VEGFA基因3'UTR片段(279bp)。切胶,用凝胶回收试剂盒回收;将回收的PCR产物用NcoI和HindIII双酶切。酶切体系如下回收的PCR产物15μ1NcoI(IOU/μ):μHindIII(IOU/μ):μIOXkBuffer:2μ1BSAμ共20μ1。按以上双酶切体系配制并离心混匀,37°C酶切过夜。再次回收以备连接使用。步骤三连接反应。将经过双酶切的pGL3-promoter载体和VEGFA基因3',16°C过夜。反应体系如下VEGFA基因VUTR酶切回收产物15μ1pGL3-promoter酶切回收产物