一种制备带有突出末端的双链dna分子的方法.docx

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产物可以经过多次纯化,获得极高纯度的产物,而且本发明的产物可以通过测序等方法验证DNA序列。5、扩展性好。本发明的方法既可用于小量操作,产生纳克级别的产物,也可以放大至微克级、毫克级,乃至更高的产量,工序一致,缩放方便。图1是不同形式的DNA末端示意2是用本发明的方法产生5’突出末端的DNA分子为例示意3是用本发明的方法产生3’突出末端的DNA分子为例示意图图4是一个长度为62Ibp,一端带有14bp5,突出末端的DNA实例示意5是一个两端分别有IObp3’突出和IObp5’突出的载体及其用途示意6是利用双重测序的方法对突出末端的验证流程示意7是实施例1中的末端验证测序结果的比对情况具体实施例方式本发明根据需要扩增的模板,分别用带有特殊标记(如生物素)的引物和不带标记的引物成对扩增所需要的片段,一对引物根据目标DNA分子的正义链设计,使带有标记的引物扩增后形成反义链而不带标记的引物扩增后形成正义链;同样地,另一对引物根据目标分子的反义链设计,使带有标记的引物扩增后形成正义链而不带标记的引物扩增后形成反义链。然后,这两种产物等摩尔比例混合,变性后重新退火,则退火后的产物中含有不带标记的目标DNA分子正义链和反义链所组成的双链DNA,这即是目标DNA分子,而其他的带有标记的分子均可以用能与标记物结合的树脂或介质(比如,针对生物素而言,可以用亲和素树脂)去除,最后留下的即目标分子。进一步,如图2所示,以产生一端带有平末端,另一端带有5’突出的双链DNA分子为例,本发明包括如下的步骤(1)根据DNA模板设计四条引物OligoFA正向引物,带有特殊标记;OligoFB正向引物,序列与OligoFA相同,不带标记;OligoRA反向引物,带有特殊标记;OligoRB:反向引物,比OligoRA长,多出的序列即目标分子中所需要的5’突出的核苷酸序列,不带标记。按照前述思路,这两对引物采用如下方式组合使用OligoFA/01igoRB这对引物产生一条较长的DNA双链,其中,正义链带特殊标记,反义链不带标记;OligoFB/01igoRA这对引物产生一条较短的DNA双链,其中,正义链不带标记,