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一种利用自身真皮成纤维细胞和脐带间充质干细胞修补皮肤和软组织缺损的方法.docx


文档分类:医学/心理学 | 页数:约11页 举报非法文档有奖
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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种利用自身真皮成纤维细胞和脐带间充质干细胞修补皮肤和软组织缺损的方法专利名称:一种利用自身真皮成纤维细胞和脐带间充质干细胞修补皮肤和软组织缺损的方法技术领域:本发明涉及一种利用自身真皮成纤维细胞和脐带间充质干细胞修补皮肤和软组织缺损的方法,属生物组织工程领域。背景技术:将一种材料(即注射剂)注入体内尤其是脸部来获得美容效果可追溯到十九世纪末。例如通过注射石蜡来纠正轮廓缺陷在“一战”前得到短期接受。但是并发症的存在,长期效果不理想使这种做法遭到放弃。可巧注射的硅氧烷的获得使这一过程从本世纪六十年代起重演。特制的医用硅氧烷溶液。对硅氧烷的局部和全身性反应,注射物的迁移,局部组织断裂,已经限制了硅氧烷注射方法的应用。虽然这种方法的最初提议者仍然用有限的受治者来继续他们的实验计划,但这种方法不可能被更多的外科和内科医生接受。注射非生物材料的不良效果促使人们尝试利用外源蛋白,尤其是牛胶原来作为注射物。虽然未加工的牛胶原给人体注射免疫原性太强,但如果病人经过预先筛选,排除了那些免疫反应性的病人,用酶降解去除牛胶原氮端或碳端,产生的“无末端胶原(atelocollagen)”的材料还是可以限量使用。溶液态无末端胶原已证明不能完全令人满意,因为该材料在几周到几月的时间里会被受试者从注射部位吸收不被宿主材料替换。虽然有人考虑过用重复注射等方法,但这些方法因为牛无末端胶原产生免疫反应,其成本较高,病人抵制等原因而实际上应用有限。为了克服这些限制,牛无末端胶原可进一步加工:先用戊二醛交联,然后用细筛滤过并剪切。制备和利用这些产品的描述可见美国专利4,582,640号和4,642,117号。交联所期望提供的优点一增加对宿主降解的抵杭,也因产品粘性的增加而有所抵梢。粘性的增加,尤其是粘性不规则(团块现象)使该产品更难以使用,甚至在某些方面无法使用。举例可见美国专利5,366,498号。牛胶原产品的免疫原性限制了人体使用,促使一些人考虑从胎盘中(举例可见美国专利5,002,071号和手术样品中(举例可见美国专利204,969,912号以及5,332,802号)提取人胶原。因为人胶原和牛胶原经受同样的降解过程,需要进一步的交联和其它化学修饰。无明显证据表明注射人胶原比牛胶原产生的效果更持久,而且,。明显地,虽然自身的经加工的胶原消除了牛胶原的免疫原性,但它和牛胶原一样不能保证长期治疗效果。而且,它局限于动过手术的受治者。总而言之,没有一个现有的非生物可注射材料可以完全令人满意地增加近邻真皮和软组织。本发明利用自身正常真皮组织中的活细胞,增加缺损下临近真皮和皮下组织体积,达到修补皮肤和软组织缺损等美容效果。同时,由于细胞来源于自身,可降低免疫排斥效果。发明内容本发明部分基于这样的认识:理想的用于增加缺损下临近真皮和皮下组织体积的材料应该是正常情况下存在于真皮组织中的活细胞。本发明还基于这样的认识:通过在注射前几周从受治者得到活体样品,然后培养来可提供大量所需类型自身细胞。本发明进一步还基于这样的认识:经过这样的组织培养扩增,自身细胞会含有一定量的抗原性蛋白,但是只要依照本申请的指导进行,这种蛋白可在注射前去除。本发明可以通过注射任何可扩大培养的未分化的中胚层细胞来进行。因为真皮成纤维细胞易于获得且易于培养,而且是真皮及其下部近组织正常成分,因此在一个优选实施方案中,用它来注射(见图1和图2)。图一:对照组的免疫组化图片(200X)图二:注射组的免疫组化图片(SP染色法,200X)从图片中得出:注射组的皮肤切片中,胶原纤维层明显变厚,细胞致密。足以证明,该发明能显著改善皱纹,并具有能够修复皮肤疤痕的功效。具体实施例方式脐带间充质干细胞的制备:胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带,用生理盐水冲洗脐带,再用医用酒精消毒,将脐带置于脐带保存液中2-8°C恒温保存,从母体中抽取母血以及从胎盘端抽取脐血各不少于4ml作为检测样本,从胎盘端另抽取脐血4ml做收集血清用。脐血、母血检测样本检测合格后,将实验室的脐带分离成l_3mm3的组织块,脐带的分离步骤是沿脐带结扎内侧剪断,加入适量的生理盐水清洗至表面无血溃后将脐带剪成2-3cm的小段,沿脐带静脉血管剪开并剥离静脉血管壁和动脉血管,剥离出华通氏胶后将华通氏胶移至离心管中,用组织剪将华通氏胶剪碎至1-3_3大小的组织块,脐带从截取到实验室分离前的时间不能超过24小时。将接种组织块的培养瓶置于37°C、含5%的CO2、饱和湿度的培养箱中培养,每3天更换一次完全培养基,培养10-20天后得到PO代脐带间充质干细胞;传代培养待脐带间充质干细胞PO代长至细胞融合80%-90%后,%的胰酶消化后I:3传代得到Pl代脐带间充质干细胞,依此扩增可得到P5代的间充质干细胞。真皮成纤维细胞培养从2X5_全层活体皮肤样品开始。因为移植外科医师和免疫学家所熟知的同种异型排斥反应,培养的成纤维细胞与宿主组织相容甚为关键。从待修正其皮肤缺损的受治者获得一块活体样品,并从它开始培养成纤维细胞可确保组织相容性—致。开始培养前,将活体样品在抗生素和杭真菌试剂中多次漂洗,然后20小心地去除表皮和皮下脂肪组织一以便得到的培养物基本上没有非成纤维细胞;将真皮用手术刀或手术剪尽量切开。样品切片逐个用镊子置于一个干玻璃培养皿上。待其贴壁5-10分钟后,缓慢加入少量培养液,注意不要吹起贴壁的组织块。孵育24小时后,再添加一些培养基。用T培养瓶开始培养时,--3周,到时候细胞就可以从最初的培养瓶中取出扩增。在培养的早期阶段,组织块需要保持贴附在培养皿底部。脱离的组织块需要重新植入新培养瓶中。依照这方面专业人员熟知的技术,组织培养物短暂暴露于EDTA-胰蛋白酶可以刺激成纤维细胞的生长。暴露应该短暂到不足以使成纤维细胞从皿底脱离。当培养物建立起来而快达到融合时,成纤维细胞可以采样冻存。冻存宁早勿晚,因为正常成纤维细胞的传代次数是有限的。任何从活组织检查样品中扩增真皮成纤维细胞培养方法,都可以用于本发明来扩增细胞,《动物细胞培养:实用方法指南》《动物细胞培养:基本技术手册》。这些书做为以参考文献并入该申请。任何适合做原代成纤维细胞培养的培养液都可应用。大多数情况下,%-20%(V/V)的血清来加快成纤维细胞的生长。血清浓度越高,细胞生长更快。在一个优选实施方案中,血清是胎牛血清,加到终浓度为10%。例如可以用高葡萄糖DMEM(GIBC0,31600034)作培养液,添加2mM谷氨酰***(Sigma,G-3126),110mg/L的***酸钠(Sigma,P2256),10%(v/v)胎牛血清(Gibco,16000-044)和抗生素(Sima,P7539)即形成“完全培养基”。细胞可以胰蛋白酶消化后在新培养瓶传代,例如一瓶细胞可以分做三瓶来养。三底T型培养瓶有450平方厘米的培养面积,可以用于该发明,一个三底T型培养瓶可以接种6XIO8个细胞,。通常5-7天后细胞可以长满,这时生长液换成无血清完全培养基;然后细胞孵育在一也就是保持在30-40°C至少6小时,12小时以上更好。最好是在37°C无蛋白培养基中孵育16-18小时。细胞培养在无血清培养液中培养,基本上可以去除细胞所带的衍生于牛血清蛋白的蛋白质。这些蛋白对人体是免疫原性的,如果存在于注射物中,可以产生变态反应。无血清培养结束后,将细胞从培养瓶中用胰蛋白酶/EDTA消化下来,通过离心重悬彻底洗涤。最终悬于等体积注射用等张盐水中以备注射。六个三底T型培养瓶可以长满可以收获IO5细胞,。或者是,只要在配制成悬液的18个小时内被注射,这些细胞被转移到4°C。细胞悬浮于等体积的完全培养基中用于运送,除了缺乏酚红PH指示剂,用受试者血清代替胎牛血清。细胞可在到运送培养基中吸出和注射。重悬细胞的盐水或者运送用培养基的体积,要求并不严格。它取决于实施者打算注射的细胞数量,待治疗缺损的大小和数目,受治者对治疗效果要求的迫切性等因素。实施者可以让细胞悬液的体积大一些,这5样在每个注射部位注射的细胞相应就会少一些。用于获得细胞粘稠悬液的变通方法:本发明提供了一种制备注射用细胞悬液的变通方法,适用于真皮修复需要大量材料的情况。加厚嘴唇,治疗鼻唇褶和皮下缺损就可遇到这种情况。变通方法和上面描述的方法在细胞培养到IXIO6以前是一样的。在直径IOOmm的培养皿中,加入2ml受体的血桨和50-100单位的自身凝血酶,使其底部形成血浆凝块,处理以后可以形成一个细胞培养面。将悬于35ml的IXIO6个培养成的真皮成纤维细胞接种于凝块表面,在完全培养基中继续培养7天。到7天时,完全培养基换成无血清培养基。在某种操作方法中,以一小时的间隔换两次培养基,然后将细胞在无血清培养基中继续培养1416小时可以获得满意的效果。在无血清培养基中孵育完成后,凝块可以吸入注射器,随时注射。在本发明一个变通实施方案中,成纤维细胞不做成悬液,而是以完整凝块形式或者用手术刀切成所需形状来使用。在真皮擦伤时,这种接种有成纤维细胞的凝块表面做为受治者的真皮的覆盖物。将细胞用于实验动物:本发明的悬液可以用来治疗皮肤缺损。细胞悬液可以用来替代无末端胶原,而且具有以上开列的优点。本发明的一个方案,可以用来治疗细微的皱纹,方法如下:先用酒精处理待治疗区,然后将之牵拉成平面;取一注射器,装满细胞悬液,安上30ga的针头,尽量表浅地将针头刺入该区一夹角的方向并不关健一轻轻加压,进行真皮内注射,直到可以看到局部轻微发白,注射多个地方。实施事例:采用7周以上裸鼠,紫外灯下照射致使其产生皱纹。照射时间为4小时/天,连续照射7天。本发明所述混合细胞注射液,该注射液含细胞总量为IX105,其中成纤维细胞与间充质干细胞的比例为2:3。选择裸鼠背部为注射区域,选择直径为2cm的圆形面积作为注射区域。取一注射器,装满细胞悬液,安上针头,进行皮内注射。在该圆形范围内,注射点为8-10个。注射时间间隔为一周,共在同一皮肤范围内注射4次。完成最后一次注射后,间隔10天,处死实验动物。用免疫组化方法观察皮肤胶原纤维层的变化情况。对照组选取同龄(12周)裸鼠,生理盐水注射,注射方法同实验组。,它包括:a)提供基本上没有免疫原性蛋白的经过传代的自体真皮成纤维细胞;b)提供基本上没有免疫原性蛋白的同种脐带间充质干细胞;c)确认容易靠增加下临近皮下和真皮组织来改善的缺损;d)把有效体积的悬液注射到缺损下临近组织使其加厚。,成纤维细胞与间充质干细胞按照各种比例的配比均在本发明专利的保护范围内。,成纤维细胞与间充质干细胞的配比比例优选为2:3。,其中缺损指:皮肤纹、皮肤扩张纹、凹陷性疾痕、非创伤性皮肤凹陷或者嘴唇发育不良。,其中悬液还包括足以形成可注射胶的有效量的动物纤维蛋白。,其中可注射胶包括凝血酶激活的自身血浆。,还包括下列步骤:a)采集实验动物真皮活体样品;b)-20%非人血清的培养基中传代,以提供基本上无脂肪细胞,角质细胞和细胞外基质的成纤维细胞;c)将传代的真皮成纤维细胞在无血清培养基中于30-40°C孵育至少6小时;d)将孵育的成纤维细胞用蛋白水解酶消化以悬浮成纤维细胞。,还包括以下步骤:a)采集同种哺乳动物的脐带;b)原代培养将接种组织块的培养瓶置于37°C、含5%的CO2、饱和湿度的培养箱中培养,每3天更换一次完全培养基,培养10-20天后得到PO代脐带间充质干细胞;c)传代培养待脐带间充质干细胞PO代长至细胞融合80%-90%后传代,依此扩增可得到P5代的间充质干细胞。,其特征是:所述脐带保存液包括培养液DMEM/F12、青霉素、链霉素、庆大霉素、磷酸盐缓冲液PBS中的一种或几种的组合。:a)一种皮下注射器,它有一个注射腔,腔内有一个推杆,腔有一个出口和外界相通;b)一种悬液包括:(1)从受治者获得的成纤维细胞-该成纤维细胞基本上没有非成纤维细胞,细胞也基本上没有对该受试者有免疫原性的蛋白;(2)从同种动物脐带来源的脐带间充质干细胞,细胞也基本没有对该实验动物有免疫原性的蛋白;(3)一种药学上可以接受的载体溶液该悬液置于注射器腔内;c)一种安在注射器出口的皮下针头。、8的设备的制做方法,包括以下部分:a)采取受治者真皮活体样品;b)-20%非人类血清的培养液传代,以提供基本上没有成纤维细胞以外细胞的真皮成纤维细胞;c)将传代的真皮成纤维细胞在30-40°C用无血清培养液孵育最少6小时;d)将孵育过的细胞暴露于蛋白水解酶以悬起成纤维细胞;e)在悬起的成纤维细胞中加入药学上可以接受的载体溶液来形成一种悬液,将该悬液置于注射器腔。,它包括以下步骤:a)提供一种接种真皮成纤维细胞和间充质干细胞的混合悬液的,这种细胞悬液不含对受试动物有免疫原性的蛋白;

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