下载此文档

一种乙型流感病毒Vero细胞冷适应株及其应用的制作方法.docx


文档分类:医学/心理学 | 页数:约21页 举报非法文档有奖
1/21
下载提示
  • 1.该资料是网友上传的,本站提供全文预览,预览什么样,下载就什么样。
  • 2.下载该文档所得收入归上传者、原创者。
  • 3.下载的文档,不会出现我们的网址水印。
1/21 下载此文档
文档列表 文档介绍
该【一种乙型流感病毒Vero细胞冷适应株及其应用的制作方法 】是由【421989820】上传分享,文档一共【21】页,该文档可以免费在线阅读,需要了解更多关于【一种乙型流感病毒Vero细胞冷适应株及其应用的制作方法 】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种乙型流感病毒Vero细胞冷适应株及其应用的制作方法一种乙型流感病毒Vero细胞冷适应株及其应用的制作方法本发明提供一种乙型流感病毒Vero细胞冷适应株及其应用,其命名为B/Yunnan/2/2005Vca(By),微生物保藏号为:。该毒株能在Vero细胞上连续传代培养,血凝滴度保持在1:512-1:1024,~,经鉴定具有Ca、Ts表型和Att特性。该毒株可以作为母本株与流行株遗传重配,或者采用反向遗传学技术将其6个内部基因与流行株2个表面蛋白基因进行基因重配,获得含流行株表面抗原的Vero细胞冷适应株,可应用于制备Vero细胞流感减毒活疫苗或流感减毒活疫苗,也可用于流感灭活疫苗的生产。【专利说明】—种乙型流感病毒Vero细胞冷适应株及其应用[0001]【技术领域】:本发明涉及一种乙型流感病毒Vero细胞冷适应株,并涉及以此适应株作为母本毒株与其他流行毒株进行重配,从而获得含有流行株表面抗原的Vero细胞冷适应株,以作为制备Veix)细胞流感减毒活疫苗或流感减毒活疫苗以及流感灭活疫苗的毒种,属于生物制品【技术领域】。[0002]【背景技术】:流感病毒(influenzavirus)是一种能引起急性呼吸道疾病的病毒,具有高度传染性,主要经空气飞沫传播,因此它能在短期内突然发生,迅速蔓延,造成不同程度的流行,甚至世界大流行,发病率高并伴有一定的死亡率,是目前人类尚不能有效控制的世界性传染病。[0003]流感病毒属于正粘病毒科,其病毒颗粒呈球形或丝状,核衣壳呈螺旋对称,病毒基因组为单股负链分节段的RNA,有包膜。根据病毒核蛋白(NP)和基质蛋白(MP)的抗原性,可将流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型,其中甲型和乙型流感病毒的基因含有8个RN***段,丙型流感病毒的基因含有7个片段;甲型流感病毒又可根据流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性不同,再分为若干亚型。甲型流感病毒常以流行形式出现,乙型流感呈局部爆发,丙型流感主要是以散发形式出现。其中甲型和乙型流感病毒与人类有密切联系,甲型流感病毒除感染人外,还可感染飞禽、猪、马等动物。而人在生活中与这些动物接触频繁,为流感病毒产生变异提供有利条件,变异后的病毒会导致流感流行,变异程度大则导致大流行。[0004]乙型流感病毒是流感的主要病原之一,只有一个亚型,宿主特异性较强,至今只发现感染人和海豹。1990年就已经报道了世界范围内流行的乙型流感病毒,根据其抗原特性和HAl区的核苷酸序列,可以分为两大谱系,代表的毒株分别为B/Yamagata/16/88和B/Victoria/2/87(这两大谱系分别简称为Yamagata系和Victoria系)。同甲型流感病毒一样,乙型流感病毒也是通过在HA和NA基因上的点突变和多种氨基酸选择性突变,特别是血凝素的重链区(HAl)的变异,改变抗原特性来逃避机体已有的免疫保护,从而不断导致流感的流行。因此乙型流感病毒抗原是三价流感疫苗的重要组成部分。[0005]接种流感疫苗是预防和降低流感严重程度的最有效手段,包括灭活疫苗和减毒活疫苗。1941年鸡胚制备的流感灭活疫苗在美国首次获得批准,在全世界得到广泛应用。目前使用的主要是用鸡胚制备的灭活的流感三联裂解疫苗,包括甲型流感病毒H1N1株、H3N2株和乙型流感病毒毒株。疫苗株的组分是由WHO根据每年全球流感病毒的变化规律,推荐的用于下一年度疫苗生产用流感病毒流行株的表面抗原来确定的。[0006]流感减毒活疫苗因具备滴鼻途径接种、提供粘膜免疫和细胞免疫且免疫保护更持久的特点,而优于灭活疫苗。目前只有美国和俄罗斯生产流感减毒活疫苗,其疫苗种子批均来源于鸡胚高产的流感病毒冷适应株,在美国为A/AnnArbor/6/60(H2N2)和B/AnnArbor/1/66,在俄罗斯为A/Leningrad/134/17/57(H2N2)和B/USSR/60/69。[0007]但是,以鸡胚作为培养基质存在以下不足之处:⑴潜在污染、可能造成鸡传染病因接种疫苗而波散;(2)连续传代常变异,造成疫苗与人群中流行毒株不匹配,使疫苗效力降低;(3)培养周期过长,难于大规模生产以满足流感大流行突发性需求;(4)纯化过程复杂;(5)易引起过敏反应。尤其是2003年以来全世界范围内高致病性禽流感的流行,使采用鸡胚生产流感病毒疫苗风险性增加。研究出安全有效的疫苗已经成为流感疫苗重要研究方向,尤其要应对流感大流行时不受鸡胚来源限制,世界卫生组织建议用哺乳动物细胞培养流感病毒来替代鸡胚制备流感疫苗。[0008]现在用于制备流感疫苗的哺乳动物细胞主要是狗肾细胞(MDCK)和非洲绿猴肾细胞(Vero)。虽然MDCK细胞是培养和分离流感病毒较好的哺乳动物细胞系,但其存在潜在的致瘤性,使得其应用于疫苗生产顾虑重重。非洲绿猴肾细胞(Vero)是世界卫生组织批准的可用于人用疫苗生产的传代细胞系,其遗传背景较为清楚,无潜在的致瘤性,安全可靠,且能利用生物反应器进行大规模培养,短期内供给量大。另外,用VeiO细胞研制的流感疫苗,可以使机体产生相对较强的体液免疫效应和细胞毒性T淋巴细胞反应。目前VeiO细胞已广泛用于狂犬、乙脑、脊髓灰质炎、肾综合征出血热等疫苗的生产。但是,Veix)细胞并不是流感病毒的敏感培养基质,产量较低且多数病毒不能在Vero细胞上连续增殖。我们研究Vero细胞流感多年,已经成功筛选出一株甲型流感病毒Vero细胞高产适应株,在此基础上,如何进一步选育出流感病毒Vero细胞冷适应株,使其能够在25°C也能大量复制且连续高产,成为了VeiO细胞流感减毒活疫苗研发的难题。[0009]反向遗传学,相对于经典遗传学而言,是在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰,如定点突变、基因插入/缺失及基因置换等,再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组,让其装配出具有生命活性的个体,研究生物体基因组的结构与功能,以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。目前反向遗传学已应用于流感病毒跨种属传播机制、病毒毒力及其致病性研究和疫苗研发。应用于疫苗研发,即6+2重配,例如将鸡胚高产株的六个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、Μ、NS)和当前流行毒株的HA和NA加以重配,获得流行株的鸡胚高产株,用以生产疫苗。相对于传统流感疫苗研制方法耗时繁琐、并且要求足够的鸡胚供应,反向遗传学可以使疫苗的研制周期缩短、工艺简化。因此反向遗传学是应对流感大流行的一个重要手段。[0010]综上所述,流感仍是人类尚不能有效控制的世界性传染病,接种流感疫苗是预防流感主要手段,减毒活疫苗优于灭活疫苗。目前使用鸡胚作为制备流感疫苗的基质,存在很多不足之处,使用Vero细胞制备流感疫苗成为流感疫苗发展的重要方向。如何选育出流感病毒VeiO细胞冷适应株,使其不仅在33°C而且在25°C也能大量复制且连续高产,成为了Vero细胞流感减毒活疫苗研发的难题。[0011]目前所用的流感疫苗生产毒种都是与鸡胚高产株重配或天然的鸡配适应株,其一般在Vero细胞上不敏感。国内和国外有厂家直接将WHO提供的流感疫苗生产毒种接种Vero细胞产毒量低或产量不稳定,制约了利用Vero细胞培养流感病毒制备流感疫苗的应用。【发明内容】[0012]本发明的目的之一在于提供一种新的乙型流感病毒Veix)细胞冷适应株,且在Vero细胞上25°C可连续传代并保持稳定高产,该乙型流感病毒Veix)细胞冷适应株具有G、7?表型和特性。[0013]本发明提供的乙型流感病毒Vero细胞冷适应株,被命名为B/Yunnan/2/2005Vca(B),其保藏号为:,保藏单位为:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为:北京市,中国科学院微生物研究所;保藏时间为:2012年12月19日。[0014]本发明的目的之二是提供所述乙型流感病毒VeiO细胞冷适应株B/Yunnan/2/2005Vca(B)的制备方法。[0015](B)通过下列方法获得:,接种IMOI的血凝滴度达到1:512的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Va(B),在维持母液成分为MEM或DMEM/F12,青霉素-链霉素2万U/ml,谷氨酰***—,牛血清白蛋白lmg/ml,TPCK-—,—,33±I°C条件下,培养72小时后,收获病毒液;,接种到24小时长成致密单层的Vero细胞上,再重复步骤A和B,如此连续传3代,并维持种毒细胞收获液的血凝滴度在1:512,得传代乙型流感病毒;,接种IMOI的步骤B的传代乙型流感病毒,在维持母液成分为MEM或DMEM/F12,青霉素-链霉素2万U/ml,谷氨酰***—,牛血清白蛋白lmg/ml,TPCK-—,—,32±1°C条件下,培养72小时后,收获病毒液,其血凝滴度在1:256,得传代乙型流感病毒;,接种IMOI步骤C的传代乙型流感病毒,在维持母液成分为MEM或DMEM/F12,青霉素-链霉素2万U/ml,谷氨酰***—,牛血清白蛋白lmg/ml,TPCK-—,—,31±I°C条件下,培养72小时后,收获病毒液,其血凝滴度在1:160,得传代乙型流感病毒;,接种IMOI步骤D的传代乙型流感病毒,在维持母液成分为MEM或DMEM/F12,青霉素-链霉素2万U/ml,谷氨酰***—,牛血清白蛋白lmg/ml,TPCK-—,—,30±I°C条件下,培养72小时后,收获病毒液,其血凝滴度在1:160,得传代乙型流感病毒;,接种IMOI步骤E的传代乙型流感病毒,在维持母液成分为MEM或DMEM/F12,青霉素-链霉素2万U/ml,谷氨酰***—,牛血清白蛋白lmg/ml,TPCK-—,—,29±I°C条件下,培养96-120小时后,收获病毒液,其血凝滴度在1:160,得传代乙型流感病毒;,接种IMOI步骤F的传代乙型流感病毒,在维持母液成分为MEM或DMEM/F12,青霉素-链霉素2万U/ml,谷氨酰***—,牛血清白蛋白lmg/ml,TPCK-—,—,28±I°C条件下,培养96-120小时后,收获病毒液,其血凝滴度在1:80,得传代乙型流感病毒;,接种IMOI步骤G的传代乙型流感病毒,在维持母液成分为MEM或DMEM/F12,青霉素-链霉素2万U/ml,谷氨酰***—,牛血清白蛋白lmg/ml,TPCK-—,—,27±I°C条件下,培养96-120小时后,收获病毒液;,接种到24小时长成致密单层的Vero细胞上,再重复步骤H和I,如此连续传代4代,种毒细胞收获液的血凝滴度在波动于O—1:80,得传代乙型流感病毒;,接种IMOI步骤I的传代乙型流感病毒,在维持母液成分为MEM或DMEM/F12,青霉素-链霉素2万U/ml,谷氨酰***—,牛血清白蛋白lmg/ml,TPCK-—,—,26土1°C条件下,培养96—120小时后,收获病毒液;,再次接种到24小时长成致密单层的Vero细胞上,再重复步骤J和K,如此连续传代10代,病毒始终保持低水平复制状态,得再传代乙型流感病毒;,接种IMOI步骤K的传代乙型流感病毒,在维持母液成分为MEM或DMEM/F12,青霉素-链霉素2万U/ml,谷氨酰***—,牛血清白蛋白lmg/ml,TPCK-—,—,25±I°C条件下,培养120-168小时后,收获病毒液;,接种到24小时长成致密单层的Vero细胞上,再重复步骤L和M,如此连续传代31代,得血凝滴度在1:512-1:1024的乙型流感病毒Vero细胞冷适应株。[0016]所述步骤A的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Va(B)为现有病毒,其保藏号为:,。[0017](B)的基本特征:(a)透射电镜观察到所得的流感病毒直径约为80-120nm,具有囊膜的较为典型的流感病毒形态;(b)基因序列分析表明在连续传代培养过程中,不易产生流感病毒基因变异;(c)流感病毒在25°CVero细胞上连续传代培养,血凝滴度可保持在1:512;(d)HI实验表明病毒的HA抗原可被羊抗或其它动物抗B亚型流感病毒高免血清特异性识别;(e)B/Yunnan/2/2005Vca(B)活病毒经自然途径感染SPF鸡后,感染鸡无发病和死亡。[0018](B)的应用,即以乙型流感病毒Vero细胞冷适应株作为母本株与其他流行毒株进行重配,从而获得流行株的

一种乙型流感病毒Vero细胞冷适应株及其应用的制作方法 来自淘豆网www.taodocs.com转载请标明出处.

相关文档 更多>>
非法内容举报中心
文档信息
  • 页数21
  • 收藏数0 收藏
  • 顶次数0
  • 上传人421989820
  • 文件大小29 KB
  • 时间2024-04-18