一种与植物开花期相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法.docx

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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。一种与植物开花期相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法专利名称::一种与植物开花期相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法技术领域::本发明涉及一种与植物开花期相关的蛋白及其编码基因与应用。背景技术::大豆是世界上最为重要的油料作物和高蛋白粮食作物。在我国,大豆是四大粮食作物之一,对保证国家粮食安全、改善城乡人民生活和增加农民收入有十分重要的作用。大豆是典型的短日照作物,单个品种的适应范围大都在1-,不同纬度地区间引种会因日照长度的变化导致开花期、成熟期提前或延迟,造成产量下降甚至颗粒无收。因此,培育对光周期相对钝感的广适应大豆品种一直是大豆育种的重要目标。通过常规育种方法培育大豆品种虽有很大成效,但在光周期反应敏感性改良方面进展较为缓慢,目前,迫切需要采用分子育种手段,通过外源基因的引入或对内在基因的遗传操作,定向调节大豆品种的光周期反应敏感性,加快广适应大豆品种的选育进程。近年来,对拟南芥和水稻等模式植物开花途径的研究揭示了光周期调控植物开花的机制。相关研究表明,长日植物(如拟南芥)和短日植物(如水稻)开花的分子途径在进化上是保守的。因此,可借助植物开花相关基因的保守性从双子叶短日植物大豆中克隆、筛选光周期反应关键基因,通过改变光周期条件来分析其表达方式,并通过遗传转化进一步验证该基因的功能,进而通过基因操作手段获得光周期反应敏感性不同的大豆品种。在拟南芥中,光受体接收外界光信号后,ws7^vc^)传递到下游基因尸:r(fzo『^/m;丄oct/sr),激活尸r的表达,进而诱导花分生组织特征基因^尸/的表达。在水稻中,7w^为/t的同源基因,也具有促进开花的作用。对拟南芥和水稻的研究表明,Fr和/^3a是光信号的整合因子,是促进植物开花的关键基因。拟南芥的开花促进因子尸7属于RKIP家族,此家族基因的特点为其编码的氨基酸序列具有保守的RKiP区域。通过转基因方法对尸r及其同源基因进行遗传操作,使其过表达或抑制其表达,可改变植物的光周期反应敏感性,为通过分子手段培育广适应作物品种创造条件。发明内容本发明的目的是提供一种与植物开花期相关的蛋白及其编码基因。本发明所提供的与植物开花期相关的蛋白,名称为GmFT,来源于豆科、大豆属、栽培大豆(G(yc/wemax(L.)Merrill),是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物开花期相关的由1)衍生的蛋白质。序列表中的序列2由176个氨基酸残基组成,自氨基末端第22-165位为RKIP结构域。为了使l)中的GmFT便于纯化,可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表l所示的标签。)中的GmFT可人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。上述2)中的GmFT的编码基因可通过将序列表中序列1的自5'末端第81-611位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子,和/或进行一个或几个碱基对的错义突变,和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述与植物开花期相关蛋白的cDNA基因也属于本发明的保护范围。与植物开花期相关蛋白的cDNA基因具体可为如下l)-4)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列i的自5'末端第8卜611位脱氧核糖核苷酸;2)其核苷酸序列是序列表中的序列l;3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述与植物开花期相关蛋白的DNA分子;4)与1)的基因具有90X以上的同源性,且编码上述与植物开花期相关蛋白的DNA分子。所述步骤4)中的基因,与l)的基因最好有95%以上的同源性。序列表中的序列1由888个碱基组成,其开放阅读框架(ORF)为自5'末端第81-611位碱基,编码氨基酸序列是序列表中序列2的GmFT。上述严格条件可为在6xSSC,%SDS的溶液中,在65°C下杂交,然后用2xSSC,%SDS和lxSSC,%SDS各洗膜一次。扩增上述GmF堪因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。含有上述与植物开花期相关蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有Gm尸r基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等,如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pC腦IA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明与植物开花期相关蛋白编码基因GwFr的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主既可以是水稻等单子叶植物,也可以是拟南芥、大豆等双子叶植物。使用Gm尸r基因构建重组植物表达载体时,在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子,如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等,它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用;此外,使用本发明的基因构建植物表达载体时,还可使用增强子,包括翻译增强子或转录增强子,这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等,但必需与编码序列的阅读框相同,以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对所用植物表达载体进行加工,如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑,可不加任何选择性标记基因,直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体具体可为在p3301m的多克隆位点间插入序列表中序列1的自5'末端第81-611位脱氧核苷酸得到的重组质粒p3301m-FT;所述p3301m是用和^bo^I分别双酶切pBI121和pCAMBIA3301,连接pBI121的3kb酶切产物和pCAMBIA3301的11256bp酶切产物,即得到p3301m。本发明的另一个目的是提供一种培育开花期提前的转基因植物的方法。本发明所提供的培育开花期提前的转基因植物的方法,是将上述与植物开花期相关蛋白的编码基因GmFr导入植物中,得到开花期提前的转基因植物。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物,如水稻、拟南芥、大豆等。所述植物具体可为拟南芥或大豆。本发明构建了GmFr的过表达载体,并将其转入野生型拟南芥植株中,实验证明,5转入GmFr的拟南芥植株开花期明显提前,说明GmFT是与植物开花期相关的蛋白,GmFT蛋白及其编码基因可用于改变植物开花期。图1为GmFr的EST序列的PCR扩增产物电泳图谱图2为的全长cDNA的PCR扩增产物电泳图谱图3为Gm^T在光周期反应敏感大豆品种贡选一号生长点中的表达图4为GwFr在光周期反应敏感大豆品种贡选一号叶片中的表达图5为G/n尸r在光周期反应钝感大豆品种黑河27生长点中的表达图6为G/niT在光周期反应钝感大豆品种黑河27叶片中的表达图7为重组表达载体p3301m-FT的质粒图谱图8为T3代转基因拟南芥植株中目基因的PCR产物电泳结果图9为T3代转基因拟南芥植株的表型鉴定结果图10为T3代转基因拟南芥植株中目的基因半定量RT-PCR产物电泳结果具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,所用引物合成及测序工作均由北京三博公司完成。实施例1、与植物开花期相关的蛋白GmFT及其编码基因的获得本实施例利用抑制差减杂交方法,获得大豆的一个EST片段,其编码的氨基酸序列具有RKIP的部分保守域。以大豆总RNA的反转录cDNA为模板,利用RACE技术(RapidamplificationcDNAends,cDNA末端快速扩增技术)得到大豆这一cDNA的3'端和5'端片段,并克隆得到Gm尸r的全长cDNA。一、EST序列的获得及验证以光周期敏感的大豆品种贡选一号为实验材料,分别设置长日照(16h,driver)和短日照(12h,tester)两种光照处理,分别在光照处理的1、7、13和19d时收集叶片,提取各时间点叶片的RNA,将上述长日照处理和短日照处理的各时间点的叶片RNA等量混合,用于下面的实验。应用抑制差减杂交法获得大量的EST序列并对其进行测序,将序列在GenBank中进行同源性比对,其中有一个EST序列所编码的氨基酸具有RKIP的部分保守域,与拟南芥中的7T基因所编码的氨基酸具有相同的RKIP保守域,由此推断这个EST片段可能是Fr在大豆中同源基因的一部分。在此EST序列两端设计引物(M1和M2,其核苷酸序列如序列表中序列9和序列10),提取短日照(12h,tester)处理的大豆叶片的总RNA,将其反转录为cDNA,利用RT-PCR方法扩增此EST序列。反应混合物如下tableseeoriginaldocumentpage7。PCR反应条件先94。C预变性5min;然后94°C30sec,55°C30sec,72°C30sec,35个循环;再72"C延伸10min,16。C保存。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果如图l所示,其中,M为GeneRulerTMDNAladderMix(MBI-SM0331)的DNA分子量标准,1和2为的EST序列的PCR产物。结果表明得到310bp的目的片段。切下目的条带,纯化回收后按照Takara公司的pMD18-T载体试剂盒说明书将PCR产物连接到pMD18-T载体上,进行测序。测序结果表明获得的310bp片段与通过抑制差减杂交所得的EST序列相同。二、5'RACE的扩增在步骤一获得的EST序列的5'端设计嵌套引物M3和M4(其核苷酸序列如序列表中序列3和序列4),分别与RACE试剂盒(FirstChoiceRLM-RACECatalog#1700)所提供的外部引物和内部引物组成引物对进行PC財广增。RACE试剂盒提供的外部引物和内部引物分别为5'-GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3'和5'-GAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3'。|(il5'外部引物()(ilM3()|ildNTPmix()|ilTaq酶(5U/(il)((il。PCR反应条件:先94。C预变性5min;然后94。C45sec,62°C45sec,72°C1min,735个循环;再72"C延伸10min,16"C保存。第一轮PCR产物稀释500倍后作为第二轮PCR反应的模板,将反应混合物中的引物改为5'内部引物和M4,其余成分不变。第二轮PCR反应将退火温度调整为65。C,其余反应程序与第一轮相同。第一轮PCR反应产物经1.(^琼脂糖凝胶电泳检测,结果呈弥散状。取第二轮PCR反应产物,%琼脂糖凝胶电泳检测,结果获得约500bp的条带。回收该片段,连接到pMD18-T载体上进行测序,测序结果表明,此片段含有约]OObp的步骤一获得的EST的5'端序列,还扩增出约400bp的新片段。三、3'RACE的扩增为获得Gm尸r的3'端序歹lj,在EST序列的3'端设计引物M5和M6(其核苷酸序列如序列表中序列5和序列6),分别与RACE试剂盒(FirstChoiceTMRLM-RACECatalog#1700)所提供的外部引物和内部引物组成引物对进行PCR扩增。RACE试剂盒提供的外部引物和内部引物分别为5'-GCGAGCACAGAATTAATACGACT-3'禾口5'-GAATTAATACGACTCACTATAGG-3'。|il3'外部引物()|ilM5(,()|ilTaq酶(5U/pl)^|ul。PCR反应条件先94。C预变性5min;然后94。C45sec,58°C45sec,72°C1min,35个循环;再72X:延伸10min,16"C保存。第一轮PCR产物稀释500倍后作为第二轮PCR反应的模板,将反应混合物中的引物改为3'内部引物和M6,其余成分不变。第二轮PCR反应将退火温度调整为64i:,其余反应程序与第一轮相同。。/。琼脂糖凝胶电泳检测,结果呈弥散状。取第二轮PCR反应产物,%琼脂糖凝胶电泳检测,结果获得约400bp的条带。回收该片段,连接到pMD18-T载体上进行测序,测序结果表明,此片段含有约250bp的步骤一获得的EST的3,端序列,还扩增出约200bp的新片段。四、全长Gm尸r基因cDNA的扩增为获得全长Gm尸r基因的cDNA序列,分别在步骤二和步骤三扩增出的5'RACE和3'RACE序列两端设计引物M7和M8(其核苷酸序列如序列表中序列7和序列8),提取贡选一号叶片的总RNA,反转录为cDNA,利用RT-PCR方法扩增全长GmFr基因,PCR反应混合物如下PCR反应条件:先94"C预变性5min;然后94°Clmin,52°C,lmin,72°C1min,35个循环;再72'C延伸10min,16t保存。%琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图2所示,其中,M为GeneRulerDNAladderMix(MBI-SM033l)的DNA分子量标准,1-4为全长GwF7基因cDNA的PCR扩增结果。结果表明获得约800-900bp的条带。回收该片段,连接到pMD18-T载体上,将获得重组表达载体命名为pMD18-GmF71。对pMD18-GwiFT进行测序,测序结果表明,获得888bp的单一条带,该888bp的核苷酸片段即为Gm尸r,其核苷酸序列如序列表中序列1所示,其编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示。核苷酸序列比对结果表明,GmFr与拟南芥的开花促进因子/%。实施例2、GmFr在大豆不同发育时期、不同组织中的表达情况选择贡选一号(光周期敏感品种)和黑河27(黑龙江省农业科学院黑河分院选育)(光周期不敏感品种)为实验材料,将两个品种的大豆分别种植在16h光照和8h黑暗的条件下直到单叶展开,然后选取生长一致的两个品种的大豆幼苗分别进行短日照(12h光照和12h黑暗)和长日照(16h光照和8h黑暗)处理。分别提取上述不同光照处理的贡选一号和黑河27不同发育时期各个组织中的总RNA,反转录为cDNA,应用Real-timeRT-PCR方法,以Gm^C77A^为内标基因,检测