下载此文档

一株联产li–f类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法.docx


文档分类:医学/心理学 | 页数:约20页 举报非法文档有奖
1/20
下载提示
  • 1.该资料是网友上传的,本站提供全文预览,预览什么样,下载就什么样。
  • 2.下载该文档所得收入归上传者、原创者。
  • 3.下载的文档,不会出现我们的网址水印。
1/20 下载此文档
文档列表 文档介绍
该【一株联产li–f类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法 】是由【开心果】上传分享,文档一共【20】页,该文档可以免费在线阅读,需要了解更多关于【一株联产li–f类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法 】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一株联产li–f类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法专利名称:一株联产li–f类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法技术领域:本发明属于微生物发酵和生物分离领域,涉及一种联产LI-F类抗生素(即LI-F抗菌脂肽,目前无中文名称,总共包括12种组分,其中分子量883、897、947、961四种也可以叫Furscidins即杀镰孢菌素)和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)菌株。利用多粘类芽孢杆菌生产的LI-F类抗生素适用于生物防治、食品加工和农产品贮藏保鲜等。背景技术:食品发酵工业、农业生产以及医药工业长期面临以下一些问题食品的微生物污染,植物病虫害,日益严重的致病菌抗药性。传统的解决方法(化学防腐剂、化学农药、抗生素)虽然可以暂时缓解矛盾,然而随着检测技术的进步以及环保意识的提高,人们开始注意到上述化学药剂的潜在危害。开发高效、安全无毒、性能稳定、广谱的天然防腐剂已经成为当前食品、医药、植物抗病基因工程领域的研究和应用热点,将具有更广阔的发展空间。基于科技的进步,检测手段的完善以及人类对生态环境意识的提高,低毒、高效、选择性强、残留时间短、对环境污染小的微生物天然防腐剂和生防试剂的研究和开发日益引起国内外专家学者的关注。微生物是地球上分布最为广泛的一大类生物,它无处不在,是一个丰富的资源宝库。细菌又作为自然界中分布最广泛的一类微生物,以其繁殖速度快、适应能力强、易于人工培养等优势,倍受微生物工作者越来越多的关注。从微生物中提取抗菌物质成本低、周期短、操作简单方便、容易实现工业化生产,而且微生物分泌的抗菌物质抑菌谱较宽,热稳定性较好,适用PH范围广,使用过程不易产生抗性菌和交叉拈抗性,因此可以发挥更大的工业应用价值。多粘类芽孢杆菌(Paenikicilluspolymyxa)是一种产芽孢的革兰氏阳性细菌,原名多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa),以形态学为分类基础,早期研究将其归入芽孢杆菌属。多粘类芽孢杆菌细胞呈杆状,革兰氏染色阳性、阴性或可变,接触酶阳性,氧化酶反应可变,厌氧条件下所测定的大多数菌株固定氮。多粘类芽孢杆菌是少数能够产生具有临床应用价值的抗生素的细菌之一,由它产生的多粘菌素B(polymyxinsB,PMB)和多粘菌素E(colistin)已在临床上用于抗细菌感染。其中的某些菌株也是重要的植物生防细菌和植物根际促生菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria,PGPR),并且在农业领域已得到广泛的应用。此外,多粘类芽孢杆菌及其代谢产物在工矿业及废水处理方面也有应用。由于其诱人的应用前景,美国环保署(EPA)将它列为可商业上应用的微生物之一,我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种。研究表明,多粘类芽孢杆菌能产生多种抗菌物质,其中包括肽类、蛋白质类、核苷类、吡嗪类和酚类等,能够防治多种植物病害。多粘类芽孢杆菌的不同菌株之间可能产生同种的抗菌物质,而同一菌株也可能同时产生多种不同抗菌物质。多粘类芽孢杆菌在生物防治、食品加工和农产品贮藏保鲜等方面非常具有应用潜力,但是要实现商业化,还必须加强4高产菌株的选育、培养基和培养条件优化、制剂研制等方面的研究。发明内容本发明目的是针对上述技术问题提供一种联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的I^aenibacilluspoIymyxa菌株以及该菌株的用途。本发明另一个目的是提供利用上述菌株进行LI-F类抗菌脂肽和邻苯二甲酸二丁酯的微生物发酵和分离鉴定方法。本发明的目的通过下列技术方案实现一株联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌菌株,该菌株为多粘类芽孢杆菌(Paenikicilluspolymyxa)JSa_9,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(),。所述的多粘类芽孢杆菌菌株在制备抗生素方面的应用,特别是该菌株在联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯方面的应用。-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的微生物发酵和分离鉴定方法,,得到抗菌物质发酵液;,收集上清液,萃取,将有机相进行纳滤,得抗菌提取物;-F类抗生素及邻苯二甲酸二丁酯;。进一步,-9产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的发酵将多粘类芽孢杆菌JSa-9接种于试管斜面营养琼脂培养基上,30°C培养MhJf菌种活化;再将试管斜面活化的多粘类芽孢杆菌JSa-9菌种接种于LB液体培养基,30°C、ISOrpm培养20Mh,至对数生长期,制成浓度为IO7108cfu/l的种子液;将多粘类芽孢杆菌JSa-9种子液以10%浓度接种于Landy发酵培养基中,在30°C和150rpm条件下培养72h,得到抗菌物质发酵液;-9产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的分离①,然后用与上清液相同体积的乙酸乙酯以萃取法抽提两次后,将有机相经过l-2nm的纳滤膜,即为获得的抗菌提取物;②多粘类芽孢杆菌JSa-9产抗菌物质高效液相色谱分析(HPLC):将多粘类芽孢杆菌JSa-9抗菌提取物采用RP-C18柱()进行HPLC分离纯化LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯;***乙酸的水和乙***溶液(三***乙酸和乙***为MERK公司产品),梯度洗脱条件为020min,乙***1040%;2030min,乙***4060%;3040min,乙***6070%;;检测波长为210nm;邻苯二甲酸二丁酯标准样品(美国SIGMA公司)也在相同条件下进行HPLC层析;LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的HPLC洗脱保留时间分别约为2530和52min;-9产抗菌物质的鉴定多粘类芽孢杆菌JSa-9抗菌提取物经HPLC分离后,各抗菌组分再利用电5喷雾电离、诱导石並撞角军离质谱(Electrosprayionizationmassspectrometry/collision-induceddissociation,ESI-MS/CID)测定其分子量和鉴定其结构。所述的方法,其中步骤b中高效液相色谱仪为美国AGILENTllOOseries,配备DVD检测器。所述的方法,其中步骤c中在质谱分析前对环脂肽样品采用弱碱性NaOH在40°C条件下处理24h水解成直链;ESI-MS/CID采用配备了电喷雾离子源的LCQDECAXPPLUSThermoFinnigan液质联用(LS-MS)设备(ThermoCorporation,USA),采用MS柱(,2μπι)进行分析,HPLC条件中流动相成分和比例与多粘类芽孢杆菌JSa-9产抗菌物质的分离步骤相同,流速为2μΙ/min;电喷雾源操作电压为5kV,操作温度为300°C,操作压力为20abr。本发明利用多粘类芽孢杆菌生产抗菌物质,其特征为该抗菌物质包括LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯,来自多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)JSa_9,经过ESI-MS鉴定两者的分子量,前者分别为883,897,911,947和961Da;后者为278Da。LI-F类抗生素是一系列环形抗菌脂肽类化合物的总称,共有12种组分。本发明鉴定出的五种LI-F类抗生素分别为LI-F04a、LI_F04b、LI_F03a、LI-F03b和LI-F05b。本发明的有益效果本发明首次提供了一种联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的Paenibacilluspolymyxa菌株。多粘类芽孢杆菌产LI-F类抗生素对多种革兰氏阳性细菌、真菌和酵母菌具有很高的抑菌活性。邻苯二甲酸二丁酯是首次在I^aenibacilluspolymyxa中发现,是聚***乙烯最常用的增塑剂,具有杀菌活性。本发明采用的I^enibacilluspolymyxa是被美国环保署列为可商业上应用的微生物菌种之一,我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种,并在农业领域已得到广泛的应用。I^aenibacilluspolymyxa抗菌脂肽LI-F类抗生素属于微生物天然抗菌肽,对人类健康和食品安全性高,不会导致对环境的污染,可用于生物防治、食品加工和农产品贮藏保鲜等。图IPaenikiciIluspolymyxaJ&1-9产LI-F类抗菌肽以及邻苯二甲酸二丁酯标样的ESI-MS图。图2PaenibacilluspolymyxaJSa-9产LI-F类抗菌肽m/。图3PaenibacilluspolymyxaJSa-9产LI-F类抗菌肽结构通式。图4PaenibacilluspolymyxaJSa_9产m/。图5菌株JSa-9的革兰氏染色。图6J&-9菌株16SrRNAPCR扩增产物凝胶电泳图。生物材料保藏信息本发明提供的该菌株为多粘类芽孢杆菌(Paenikicilluspolymyxa)JSa_9,已保6藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(Jia北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),,保藏日期为2010年11月08日。具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1广谱抗菌活性I^aenibacilluspolymyxaJSa-,采样地点包括江苏省南京市紫金山下田园、南京农业大学食品院后菜地和北苑食堂外田地,以及江西省临川市、德兴市和黑龙江省齐齐哈尔市郊区菜地等六处。[JTE缓冲液;溶菌酶(10mg/ml);SDS(10%);RNase溶液(lmg/ml)(购自天津H&);NaAc(3M),蛋白g|K(20mg/ml),10XPCRbuffer,dNTP,fDlprimer,rPlprimer(由北京三博远志生物技术公司提供);Taq酶,DNAMark(购自北京清华天为生物技术公司)。()、藤黄微球菌(28001)、大肠杆菌()、荧光假单胞菌()、黑曲霉()、点青霉(),来源于中国普通微生物菌种保藏中心。,、、蒸馏水1000ml;、121°C、20min灭菌备用,固体培养基另加1520g的琼脂。(1)营养琼脂培养基(细菌用)(沈萍等,1999),,,蒸馏水1000ml,琼脂20g,。(2)PDA培养基(真菌用)(沈萍等,1999)马铃薯200g(切片水煮30min,过滤取汁),,蒸馏水1000ml,琼脂20g,pH自然。、淀粉培养基、糖发酵培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、柠檬酸盐培养基、醋酸铅培养基等的配制均参照东秀珠等的《常见细菌系统鉴定手册》配制。,超净工作台(苏净集团安泰公司),PH计(美国Orion公司),高压蒸气灭菌锅(北京发恩科贸有限公司),恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂),隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂),高速冷冻离心机(centrifuge5804R,Eppendorf公司),电子天平(BS-200S,Sartorius公司),HYG-A全温摇瓶柜(太仓实验设备厂);PCR仪(PTC-100,MJResearch公司)。、有机质含量丰富、水分适宜的土壤区域采样,采样时按照多点取样(不同地点、不同土层深度)方法,去除表层土样,利用简易打孔器向下打取5IOcm土层,并将上下土样充分混勻,然后取几十克装入无菌牛皮袋中,并在袋上注明采集地点、日期、土样号和植被状况,迅速送回实验室立即进行分离或4°C保存备用。、研磨后,称取10g,放入250ml盛有90ml生理盐水及玻璃珠的三角瓶中,在摇床上剧烈振荡IOmin后于80°C水浴中加热20min,杀灭不产芽孢的细菌和其他菌类气采用土壤稀释分离法依次制得ιο-2、ιο-3、ιο-4、ιο-5、(Γ6、ιο-7土壤稀释液,。倒置于30°C的恒温培养箱中培养48h。挑取单菌落,镜检,将已纯化的菌株保存于营养琼脂培养基斜面4°C冰箱内备用。,采用37°C培养Mh;真菌培养于PDA培养基上,培养37天。各指示菌在接种前,用无菌生理盐水调整菌体浓度至OD6tltlnm=。抗菌活性菌株的初筛选择蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌和黑曲霉三种指示菌,而复筛中指示菌包括蜡样芽孢杆菌、藤黄微球菌、大肠杆菌、黑曲霉以及点青霉五种。

一株联产li–f类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法 来自淘豆网www.taodocs.com转载请标明出处.

相关文档 更多>>
非法内容举报中心
文档信息
  • 页数20
  • 收藏数0 收藏
  • 顶次数0
  • 上传人开心果
  • 文件大小32 KB
  • 时间2024-04-18