植物细胞骨架的光学显微观察.pptx

实验四、植物细胞骨架的光学显微观察
讲解员:赵鹏飞
一、实验目的
观察光学显微镜下细胞骨架的结构,了解显示植物细胞骨架的方法及其原理。
二、实验原理
细胞骨架(cytoskeleton)概念是指真核细胞中的蛋白纤维网络结构。具体的是指在细胞核中存在的核骨架-核纤层体系。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接,贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。
细胞骨架是指在细胞中支持和连接细胞各组分,以及与细胞运动有关的结构,它包括微管、中间纤维、微丝。当用适当浓度的Triton X一100处理时,可将细胞内大部分蛋白质抽提掉,但细胞骨架系统的蛋白质却仍被保存,经过固定和考马斯亮蓝R250染色,从而在光镜下观察到细胞骨架的网状结构。
Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 是一种非离子型表面活性剂(或称去污剂)。(C34H62O11)。它能溶解脂质,以增加抗体对细胞膜的通透性。
考马斯亮蓝R250可以对各种蛋白质进行染色。细胞骨架有一个特点,即用非离子去垢剂(例如Triton X-100)处理时可以保持非溶解状态。当用这类试剂处理细胞时,细胞内其它可溶性的物质和膜成分都被抽提出来,只留下细胞骨架。考马斯亮蓝R250虽然不能对微丝进行特异性染色,但当其他蛋白成分被抽提后,就能清晰地显示微丝束的形态。
戊二醛是一种双交联剂,渗透快,交联能力强,对蛋白质的固定效果好,且不破坏细胞骨架结构。
三、实验用品
(一)器材:显微镜、50ml烧杯、滴管、容量瓶、载玻片、盖玻片、镊子。
(二)试剂:
1、M一缓冲液:50mmol/L眯唑,50mmol/L kCl, mmol/LMgCl2,lmmol/L EGTA(乙二醇双(a一氨基乙酸)醚四乙酸) EDTA,lmmol/L巯基乙醇或DTT(二硫苏糖醇)。
2、6m mol/L 。
3、1%Triton X一100,用M一缓冲液配。
4、%考马斯亮蓝R250,,冰乙酸7ml,。
5、3%戊二醛,用6m mol/L磷酸缓冲液()配制。
6、5%、7%、95%乙醇。
7、叔丁醇、正丁醇、二甲苯、树胶。
(三)材料:洋葱鳞茎。
四、实验步骤
(1)取洋葱鳞茎内表皮细胞(约lcm2大小),使其下沉。
(2)吸去磷酸缓冲液,用1%Triton X一100处理20—30分钟。
(3)吸去Triton X—l00,用M一缓冲液洗3次,每次10分钟。
(4)3%—1小时,(对照组开始处理)。
(5),每次10分钟。
(6)%考马斯亮蓝R250染色20—30分钟。
(7)用蒸馏水洗1—2次,材料置于载玻片上,加盖玻片,即可镜检。
(8)如作永久制片,可使样品,顺序通过如下试剂:50%乙醇,70%乙醇。95%乙醇,95%乙醇和叔丁醇混合液(1:1),每次5一10分钟,或正丁醇→正丁醇二→甲苯二→甲苯,每次5—10分钟。然后捞取样品,平展于载玻片上,中性树胶封固。
五、实验结果