生物技术在法庭科学上的应用期末作业.docx

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技
术
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科
学
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第一部分简述PCR技术的原理及发展历史
什么叫做PCR技术?它是聚合酶链式反应,又称体外DNA扩增技术。是近年来发展起来的一种体外扩增特异DN***段的技术。
DNA扩增的传统方法一般采用分子克隆法,需将构建的含有目的基因的载体导入细胞进行扩增,并需要用探针进行筛选,牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术,虽然技术上已无难点,但操作复杂,需数周到数月的时间,且不利于普及。
PCR技术是由1985年由美国 Cetus 公司的Kary Mullis 首创,可以将微量目的DN***段扩增一百万倍以上。
它的优点是敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等,广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域,并已普及到许多普通实验室,大大简化了传统的分子克隆技术,从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。

PCR的原理:
用于扩增位于两段已知序列之间的DN***段,类似于天然DNA的复制过程。
以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成,重复这一过程,即可使目的DN***段得到扩增。
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合,基本反应步骤分三步:
1. 变性(Denaturation):
加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。94℃ 30″
2. 退火(复性) (Annealling):
突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,也存在两条模板链之间的结合,但由于引物的高浓度,结构简单的特点,主要的结合发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″
3. 延伸(Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度,在DNA聚合酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下,以引物的 3′端开始,结合单核苷酸,形成与模板链互补的新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过25~40个循环后DNA可扩增106 ~ 109 倍。
PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期,原来的DNA担负起使模板的作用,随着循环次数的递增,由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板,最终的扩增产物是介于两种引物5’端之间的DN***段。
PCR技术主要用于目的基因的克隆、基因的体外突变、DNA和RNA的微量分析、DNA序列测定和基因突变分析。

PCR的发展历史
PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史,本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术,Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想:“经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。
PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制,只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA ,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合适的缓冲体系,DNA变性、复