核磁共振谱在药物定量分析中的应用研究1_精品.doc

核磁共振谱在药物定量分析中的应用研究
项目完成单位:国家药物及代谢产物分析研究中心
项目完成人:贺文义
1、核磁共振1H谱检测康爱新生素胶囊甲基素的含量方法建立
药物胶囊是常用药物剂型的一种,通常对其中主要成分的检测是用色谱法或化学滴定等方法,比较费时和费力,康爱新生素胶囊中主要成分为甲基素。根据该化合物的1H谱特征峰,用TMS为外标(1‰ TMS /CDCL3),甲基素为内标,取胶囊5粒,将内空物充分混合,定量称取五份(10±mg)用1ml CDCL3溶解,温控25℃,D1=15秒,nt=8测试1H谱,经积分后按公式计算出胶囊中主要成分的含量。
实验方法:取胶囊五粒,将内容取出充分混合,将定量称取五份(±10mg),每份用1 ml CDCL3溶解,温控25℃,D1=15秒,nt=8测试1H谱。另称取甲激素±10mg在相同条件下测试1H谱,图谱以TMS为内标积分值定为10,。
计算公式:C=Ma0/Sa0==
注:M=样品量(mg) Ma= Sa×C Sa=特征峰面积积分
甲激素在胶囊中的含量=MA/M×100%
-NMR联用技术鉴定同分异构体
羧基荧光素(caboxvfluorescein)是荧光素衍生物的一种,其产品中同时含有5-FAM(caboxyfluorescein-5-imidyl ester)和6-FAM(caboxyfluorescein-6-imidyl ester),5-FAM较6-FAM更经常使用。其广泛存在于荧光标记试盒,用于DNA自动测序。本品采用Varian公司的Prostar-230D2O,CH3OH(%冰醋酸),其洗脱比例70:30,流速为1ml/min,检测器为Varian Prostar-330二极管振列检测器,紫外检测波长为242nm。,。LC-MS所得到分子量均为376。在INOVA-500 LC-NMR上,用停止流动的方法采集LC-NMR 1H谱。进样量为25 ml(2mg/200 ml), s,累加次数为256。通过1H谱分析,-FAM,- LC-NMR谱图。
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图1. 羧基荧光素混合物1H LC-=,=
3、高分辨魔角核磁共振技术定量跟踪Na-Fmoc保护的羟基氨基酸的糖基化反应
1)概述
九十年代初发展的高分辨魔角核磁共振技术(High resolution magic spinning(HR/MAS)NMR)采用魔角旋转消除非均相溶液中磁化率不同而造成的谱线加宽。另外特殊设计的超微量探头(gHX Nano Probe)与常规的高分辨液相探头不同,体积很小的样品(40µL)可以100%地保持在检测线圈内,填充因子高,样品管和塞子磁化率匹配性好,致使磁化率的不连续性达到最小,从而得到最高灵敏度和最小线宽的NMR谱图。该技术不破坏样品,可灵敏、直接地提供偶联在树脂上化合物的结构信息。目前,广泛用于监测固相合成反应;鉴定固载在单一树脂珠上化合物的结构;以及分析树脂上固载化化合物的构象等等。
该项目首先探讨了不同常规树脂、不同溶剂以及温度对高分辨魔角核磁共振技术中1H NMR线宽的影响,然后利用该技术指导优化Na-Fmoc保护的羟基氨基酸固相糖基化反应的条件,并利用该技术定量研究不同Na-Fmoc保护羟基氨基酸的固相糖基化反应。
固相组合合成糖肽库是十分热门的研究领域。该项目将Na-Fmoc保护的羟基氨基酸偶联到Teata Gel S NH2 树脂上,再在过量的乙酸化糖三氯亚氨酯供体和BF3. Et20 的催化条件下进行固相糖基化反应。用HR/MAS NMR分析技术不仅跟踪优化了固相羟基氨基酸的糖化反应条件,而且选择固载在树脂上的糖基化
Na-Fmoc保护羟基氨基酸1H NMR中最低场,且分辨好的Fmoc保护基信号做为内标,糖上乙酸基的积分面积为标准直接定量了键合在Teata Gel S NH2树脂上氨基酸苷化的产率。利用四个羟基未保护的Na-Fmoc氨基酸和七种全乙酰化糖为原料,合成了28个糖基化Na-Fmoc氨基酸,均用高分辨魔角核磁共振技术定量。该研究为进一步合成“一株一化和物”的糖肽库打下了坚实的基础。
2)结果与讨论
A 树脂、溶剂和温度对1H NMR线宽的影响
有机合成中使用的固相载体有赖于两个相互关联的部分:①不溶解但可溶胀的高聚物材料,并且该材料对合成中使用的条件是惰性的;②将底物与以上固相载体相连,并利于中间体和终产物从固相载体上全部切下来的不