萤光素酶报告基因技术.ppt

Report Smartly -萤光素酶报告基因技术
自然界的萤光
发光海星发光甲壳虫
发光真菌
发光节虫
自然界的萤光
发光鱼发光甲虫
自然界的萤光
萤火虫
报告基因的作用
细胞信号转导途径
启动子/增强子
受体结合
病毒/细胞相互作用
转录因子
药物诱导作用或”效果”
萤光
(Bioluminescence)
荧光
(Fluorescence)
是化学发光(Chemilumi- nescence)
的一种,激发能量来自化学反应
吸收来自光源的光,再发射另一光子
萤光发光计(Luminometer)
荧光计(Fluorometer)
液闪仪(Scintilation Counter)
电荷耦合装置光学成像系统(CCD opitical imaging system)
荧光显微镜
各种报告基因的优点和缺点
报告基因
优点
缺点
萤光素酶
优越的灵敏度
高信号值
无内源活性
需要底物
ß-gal
灵敏度好
细菌,血清等内源活性高
需要底物
GUS(葡糖醛酸糖苷酶)
灵敏度好
植物中内源活性低
90% 的 , 人/动物细胞中有内源活性
酶的扩散可引起“过度报告”
需要底物
SEAP(分泌性碱性磷酸酶)
分泌性报告基因(不需裂解)
在 HeLa , 癌和其它细胞类型中有高的内源活性
需要底物
CAT(***霉素转乙酰基酶)
-真核细胞没有背景表达
-易于使用
-设备现成(液闪仪,层析)
放射性的
灵敏度底
50h半衰期
GFP(绿色荧光蛋白)
显微镜: 亚细胞定位
不需底物
背景可能高
折叠“情形”可导致信号差别
萤光素酶报告基因的主要优点
非放射性
检测快(比CAT等)
灵敏度高(可比CAT检测灵敏度高100倍)
半衰期短(在理想条件下,可检测到10-20 摩尔的萤光素酶分子。在哺乳动物细胞中半衰期3小时,。而CAT在哺乳动物细胞中的半衰期约50小时)
线形范围广(在10-16 M(10pg/L)至10-8 M(1mg/L)范围内,光强度与萤光素酶浓度成正比)
一般比显微镜检测的荧光更灵敏(对多孔板而言)
生物萤光比荧光更稳定,因为自然界进化的酶能保护光子发射器
通过基因工程可以延伸生物萤光的性能和能力
萤光素酶报告基因的使用
原理:
制备含有 luc/ Rluc 的DNA
转染
提供刺激
测量萤光
调节序列
Luc2