蛋白纯化系统.ppt

BioLogic DuoFlow中高压层析系统
层析原理与操作
为什么做蛋白质纯化?
原理与操作
纯度均一的蛋白质才能满足物理化学性质研究、生物活性测定、免疫学性质、结构分析、药理毒理实验的要求,以揭示生命科学的规律。
研究开发、中试生产蛋白质药物用于诊断和治疗。
实验室研究
A、天然生物样品
纯度均一的蛋白质
纯化
B、重组基因工程药物
C、蛋白质组研究
差异蛋白质
质谱测序
克隆表达
分离纯化蛋白质是生命科学研究的基本且必要的技术手段,也是生物制品药物生产的最重要的工艺步骤!
其他生物分子分离纯化
原理与操作
其他生物大分子:DNA,多糖
生物小分子:多肽和小肽,核苷酸,寡糖和单糖,多环和杂环
用途:
用于性质、活性等研究需要
用于治疗和诊断的药物
用于生物、化工或食品等轻工领域的生化试剂
离心
沉淀
超滤
电泳
层析(Chromatography)
生物分离纯化技术
原理与操作
Model 491,Rotofor
Note:蛋白质分离纯化的重要问题是如何在纯化过程中保持温和的条件,从而保证在此过程中蛋白质的结构和活性不受影响。
最广泛的蛋白质分离纯化方法
条件温和
维持蛋白质空间结构与活性
层析技术
Ion Exchange (IEX)-离子交换
电荷–可用于层析的任何步骤,根据纯度要求,包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化
Size Exclusion (SEC)-分子筛(或凝胶过滤)
分子大小–用于中间纯化、脱盐和缓冲液交换、最后精细纯化
Affinity (AC)-亲和
生物相互作用–用于复杂样品的最早捕获或中间纯化
Hydrophobic Interaction (HIC和RP) -疏水和反相
疏水相互作用- 用于中间纯化,去除脂类和脂多糖
Ceramic Hydroxyapatite (CHT) & Ceramic Fluoroapatite (CFT)-羟基磷灰石
独特分离机理,包含离子交换和金属螯合等,可用于层析的任何步骤,根据纯度要求,包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化
原理与操作
层析的5个操作步骤
装柱并平衡
上样
平衡
洗脱
再生
上样
装填有层析介质的层析柱
分离
分离组分流出
原理与操作
原理与操作
层析图
第一峰, 外水体积, Vo,
不与柱中填料相互作用直接从柱中流出。这是样品中的未结合物质
Vo
Ve
Vt
蛋白质含量(A280), 由UV检测器读出,y轴
基线
洗脱峰,有些可以很好的分离,有些分得不是很好,有部分交叉
时间或体积,x轴
液相层析系统的工作流程
用Pump推动溶液…
各种Valve系统选取溶液控制流向
通过 Column 时不同蛋白分子与填料作用强度不同因而迁移速度不同从而分开…
Column 洗脱液包含的蛋白….通过检测器确定位置和浓度
Fraction Collector收集样品
原理与操作